蔣作強 貴池區(qū)動物疫病預防與控制中心 247000

車躍光 宿州市動物疫病預防與控制中心 234000

血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)由于能同時進行大量樣本分析,且因為具有試驗過程易于操作以及結果快速、準確等特點而成為我國各地動物防疫監(jiān)督機構和養(yǎng)殖場進行流行病學調查、免疫程序制定及免疫效果監(jiān)測等的主要手段之一。盡管此監(jiān)測方法操作簡便、快捷、準確和實用,但是在實踐中由于某些因素的影響,也易導致試驗結果不準確,甚至無法判定。筆者根據(jù)多年的實踐操作將實驗中的影響因素淺析如下。

1 血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)中常見問題。

1.1 對照孔凝集。

1.2 全部凝集。

1.3 紅細胞全部下沉。

1.4 標準陽性對照血清的抗體效價與原結果誤差大于1個滴度。

1.5 淚滴狀流淌(完全血凝抑制)線細。

1.6 結果出現(xiàn)慢或結果出現(xiàn)快，并且整板無凝集現(xiàn)象。

1.7 凝集板出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象。

1.8 凝集不明顯，無法判定結果。

2 問題產生的可能原因及應對措施

2.1 樣品方面

2.1.1 被檢血清腐敗變性。血樣采集后要馬上分離血清，分離后及時測定或放置在4℃冰箱內保存，力求新鮮。

2.1.2 受部分禽類血清中非特異性血凝抑制因子影響，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制試驗時會出現(xiàn)對照孔和對照孔后2～3孔有凝集現(xiàn)象。因此，在利用血凝抑制試驗進行血清抗體測定之前，有必要對血清中非特異性因子進行排除。

2.2 試劑器材方面

2.2.1 緩沖液配制時間過長，pH值發(fā)生變化，使凝集不明顯。緩沖液（PBS）盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度和酸堿度要準確，可用HCL和NAOH液調節(jié)酸堿度，并用pH試紙測試到pH值合適為止。如果用生理鹽水代替緩沖液，要使用新生產、新開瓶的生理鹽水。

2.2.2 4個血凝單位(HAU)抗原配制不準確。為防止4個HAU抗原配制不準確，在進行HI試驗前必須做4單位抗原校正。即在不加血清的情況下，第1～3孔的血球完全凝集，第4孔50%凝集呈點狀，說明4單位抗原的配制可以使用。否則，需重新測定抗原效價，重新配制4個HAU抗原，并做4單位抗原校正，直至結果準確。

2.2.3 紅細胞的來源。配制紅細胞懸液應采集2只以上成年公雞的血，一般要求用非免疫公雞，如果用免疫公雞代替，應增加洗滌次數(shù)和時間。

2.2.4 凝集板不干凈。目前，實驗單位和基層多使用一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干凈。若使用玻璃材料的96孔凝集板，V型孔底需光滑明亮,對底部磨損嚴重的反應板要及時淘汰，使用后要按程序清洗干凈。

2.3 操作方面

2.3.1 在使用微量移液器時，液體加入量發(fā)生誤差。在使用微量移液器時，每個吸頭要安裝牢固，防止漏氣。操作時手壓下的力度要均勻。移液管嘴浸入液面下的深度要力求一致，不可過深，否則留在管嘴外的液體也滴入孔內，吸取量增大，對抗體滴度產生影響。

2.3.2 在稀釋血清時，產生氣泡。倍比稀釋血清時，在吸取第一孔時要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第二孔。在反復抽取過程中，移液器滴頭不要離開液面，防止產生氣泡，造成移液量不準。

2.3.3 樣品、抗原和紅細胞懸液在使用前沒有搖勻，加入時濃度高低不一，人為造成誤差。因此樣品、抗原和紅細胞使用前一定要搖勻，保證每一孔中加入的濃度準確一致。

2.3.4 移液器滴加液體時，有時會將管嘴與凝集板孔相接觸，造成污染。尤其是在加入紅細胞懸液時，孔內已有稀釋液、抗原、血清等，如果管嘴接觸到孔內混合液，會造成各個孔內液體相互污染。所以在使用移液器時，一定要保持加樣器管嘴與凝集板孔間的距離，以保證每個凝集孔內液體數(shù)量和濃度準確。

2.3.5 在凝集過程中振動凝集板。有些操作者在實驗過程中，急于想知道結果，將凝集板隨時取放，使凝集受到影響。因此在靜置過程中一定要有耐心，等時間到時再看結果，保證實驗的準確性。

2.3.6 抗原與抗體作用時間過長或過短對結果影響較大：過短出現(xiàn)凝集不完全，過長出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。

2.3.7 結果的判定。只有陰性、陽性對照均成立，將凝集板傾斜45度后，流淌呈線狀的孔數(shù)為血凝抑制效價。

2.3.8 出現(xiàn)重復加樣或漏加樣的情況。

2.4 實驗溫度

一般要求在室溫25℃～37℃的條件下進行實驗。當溫度過低，如低于15度時，出現(xiàn)結果就要慢，往往需要超過40分鐘才能出現(xiàn)清晰的結果。當實驗溫度低于4℃時紅細胞有時會發(fā)生自凝現(xiàn)象。當試驗過程中的環(huán)境溫度超過30℃時，試驗結果出現(xiàn)就快，往往在15分鐘左右就可讀數(shù)。一旦時間過長，結果就會消失，使整板無凝集現(xiàn)象。

3 做好試驗的幾個關鍵點

3.1 實驗人員責任心要強

在進行試驗操作時，由于受多方因素的影響，很容易出現(xiàn)錯誤，所以要求實驗人員在進行試驗時要嚴格操作，綜合考慮各方面的因素，正確判斷結果。當出現(xiàn)錯誤時要認真查找原因，及時總結，以免類似錯誤再犯。

3.2 紅細胞洗滌要充分

原則上，血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)所用的紅細胞應來源于SPF雞或非免疫的健康公雞，而實際上多使用免疫過的公雞。因此，對紅細胞的洗滌次數(shù)要多，要充分，并注意轉速和時間。至少洗滌5次，前4次為1500轉/分鐘，5分鐘；第5次為3000轉/分鐘，持續(xù)5～7分鐘。

3.3 4個血凝單位(HAU)抗原配制要準確

在試驗之前要對抗原用已知效價的標準陽性血清進行標定，以確定抗原的純度。抗原配制完后，需對其進行標定，看是否達到所需標準?？乖r過高或過低對結果都有一定的影響。過高，測定抗體效價偏低；過低，測定效價過高，甚至很高。4個HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，混懸液要混勻，配好的抗原在室溫下放置不得超過4小時。