劉山輝 遼寧職業(yè)學院,遼寧鐵嶺 112001

1 試驗材料

1.1 試驗菌種來源

來源于本地區(qū)11家肉種雞場和商品肉雞場發(fā)病雞病料分離培養(yǎng)物。

1.2 藥品與試劑

（1）革蘭氏染液、美藍染液、微量發(fā)酵管（由遼寧檢驗檢疫局檢測中心提供）。

（2）致病性大腸桿菌陽性血清購自中國獸藥監(jiān)察所。

（3）抗菌原液：將各種抗菌藥物稀釋成2mg/ml，中草藥稀釋成相當于含原生藥1g/ml。

（4）中草藥組方（每克）

雙黃連：金銀花：0.4g黃連0.6g

白頭翁散：白頭翁0.35g黃連0.25g黃柏0.25g秦皮0.15g

三黃加白散：黃連0.35g黃柏0.25g黃岑0.25g白頭翁0.15g

苦參合劑：苦參0.6g黃連0.4g魚腥草粉劑：魚腥草粉劑1g穿心蓮粉劑:穿心蓮粉劑1g

1.3 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基。

1.4 藥敏紙片

購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司，中草藥藥敏紙片為自制（相當于含原生藥10mg/片）。

1.5 儀器

微量移液器、恒溫箱、微生物接種用具。

2 試驗步驟

2.1 致病性大腸桿菌的分離與鑒定

2.1.1 菌種的分離

剖檢病死雞，無菌操作采取病死雞的心血、肝臟病料接種于乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)，進一步移接至伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，挑選典型菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，作為試驗菌種保存。

2.1.2 生化試驗

將試驗菌種分別接種于微量發(fā)酵管，置滅菌培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)24～48h，觀察發(fā)酵情況。在培養(yǎng)48 h后，加入靛基質(zhì)試劑于蛋白胨水中，檢查是否有靛基質(zhì)生成。

生化試驗結果顯示，分離的菌種能發(fā)酵甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、蕈糖、果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，靛基質(zhì)試驗和M.R試驗陽性，山梨醇、鳥氨酸試驗結果陽性。V-P試驗、衛(wèi)矛醇、肌醇、硝酸鹽、酒石酸鹽、水楊素、精氨酸水解酶、阿拉伯醇、血清菊糖、鳥氨酸、精氨酸脫羧酶、丙氨酸鹽、乙酰胺利用試驗結果陰性。經(jīng)生化特性鑒別，證明病料中分離出的細菌是病原性大腸桿菌。

2.1.3 血清型鑒定

采用試管凝集方法，用每ml含10～60億菌體抗原的肉湯培養(yǎng)物，加上等量的被檢動物菌體抗原陽性血清，菌體抗原陽性血清分別為搖晃均勻，在 2～3m in內(nèi)，如發(fā)生凝集反應者為陽性反應，不凝集者則為陰性反應，根據(jù)陽性血清的抗原種類判定被檢菌株的血清型。結果如表1。

表1 大腸桿菌血清型鑒定結果

2.2 誘導前藥敏試驗

根據(jù)血清學試驗，將優(yōu)勢血清型O78作為進一步試驗研究對象。試驗前將試驗菌種在無藥乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基上繼代接種培養(yǎng)10代，盡量消除已產(chǎn)生的耐藥性。采用紙片擴散法進行藥敏試驗，用無菌棉拭蘸取菌液，無菌操作涂布接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，粘貼藥敏紙片，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～18h后觀察結果。結果如表2。

表2 誘導前藥敏試驗結果

2.3 耐藥誘導試驗

根據(jù)試驗結果，選取原始藥敏試驗中抑菌直徑大于等于15mm的抗菌藥物作為進一步試驗研究對象，進行耐藥誘導試驗。操作方法如下：

（1）取已加入5m l乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管27支，在無菌操作臺上將每管中分別用微量移液器移入一種抗菌藥物原液，計算移入藥液量，使各管中抗菌藥物濃度達到抗菌原液的10-5，混勻，并作好標記，余一管作空白生長對照。

（2）無菌操作將試驗菌種接入各試管中，作抗菌藥物的適應性培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h，結果大腸桿菌均能在該濃度培養(yǎng)液中生長良好。

（3）另取已加入5m l乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管27支，同樣的無菌操作方式，將試管中各抗菌藥物抗菌原液加至10-4，同樣作好標記，將上述適應培養(yǎng)的大腸桿菌相對應的移接至該濃度培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng) 24h。

（4）當大腸桿菌在培養(yǎng)基中生長良好時即可移接入下一個10倍梯度的對應抗菌藥物培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，否則仍在同一梯度中繼代培養(yǎng)，直至生長良好，同時記錄細菌的生長情況。觀察培養(yǎng)結果。耐藥誘導試驗結果如表3。

表3 耐藥誘導試驗結果

2.4 誘導耐藥后的藥敏試驗

當細菌不斷的適應含藥培養(yǎng)基環(huán)境而產(chǎn)生耐藥性后，隨著抗菌藥物濃度的10倍遞增，在某一濃度仍無法繼續(xù)良好的生長和繼代時，即可停止該藥物的耐藥試驗，保留末代產(chǎn)生耐藥的菌種，并分別用紙片法作末代耐藥菌種對抗菌藥物敏感試驗。結果如表4。

表4 耐藥后的藥敏試驗結果

2.5 敏感性恢復試驗

將已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌末代培養(yǎng)物分別移接至無藥的乳糖膽鹽肉湯中繼代培養(yǎng)，并作原耐藥名稱的標記，37℃培養(yǎng)24h為一代。每代培養(yǎng)后，均用原抗菌藥敏紙片作藥敏試驗，直至細菌對已耐藥的抗菌藥物敏感性最大程度的恢復，即可停止繼代培養(yǎng)，并記錄試驗結果。結果如表5。

3 試驗結果分析

3.1 鐵嶺地區(qū)雞大腸桿菌病普遍存在，分離的致病性大腸桿菌血清型為 O1、O2、O35、O36、O78、O111，其中O78為優(yōu)勢血清型。

3.2 從該地區(qū)分離出的雞致病性大腸桿菌對中草藥復方制劑呈高度敏感狀態(tài)，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生耐藥性，因此應為本地區(qū)的雞性大腸桿菌病防治的首選藥物。

3.3 從該地區(qū)分離出的雞致病性大腸桿菌對氟苯

表5 敏感性恢復藥敏試驗結果

尼考、頭孢噻呋、頭孢啉唑、多粘菌素B均為高度敏感，產(chǎn)生一定耐藥后仍呈現(xiàn)出高度敏感性，產(chǎn)生耐藥性慢并且恢復較快。因此適于本地區(qū)的雞性大腸桿菌病的防治。。

3.4 從該地區(qū)分離出的雞致病性大腸桿菌對慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、蒽諾沙星、培氟沙星，磷霉素鈉呈高度敏感狀態(tài)，但很容易產(chǎn)生耐藥，耐藥產(chǎn)生速度快，耐藥后敏感性明顯降低，呈現(xiàn)出中敏或低敏。但停藥后又能有不同程度的恢復。因此可突擊性使用防治本地區(qū)的雞性大腸桿菌病，不宜連續(xù)使用。

3.5 分離出的雞致病性大腸桿菌對磺胺類藥耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥產(chǎn)生明顯，一定時期內(nèi)無法恢復敏感性。

3.6 本次試驗的操作不在于設備和儀器的先進程度，主要是充分的應用了獸醫(yī)專業(yè)的微生物學和藥理學的基本理論，靈活機動地設計出試驗的步驟和方法，利用常規(guī)微生物實驗室和藥理實驗室的基本設備即可完成試驗內(nèi)容，對于其他類抗菌藥物和新型的抗菌藥物的試驗和測試有一定的借鑒價值。

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