謝余澄，傅 僅，楊亞麗，唐 靜

(云南省第二人民醫(yī)院病理科，昆明 650021)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓來源的一類具有多向分化潛能的成體干細胞，可分化為骨、軟骨、心肌、脂肪和肝、膽管上皮等細胞。本文旨在探索BMSCs移植治療多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)組織修復(fù)病理改變。

1 材料與方法

1.1材料 35只健康新西蘭大耳白兔，3個月齡，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由中國人民解放軍成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院實驗動物中心提供；實驗動物質(zhì)量合格證號SYXK(滇)2005-0008；實驗動物使用許可證號SYXK(軍)2007-041。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。將其隨機分為3組：(1)正常組5只，不做任何處理；(2)模型組15只，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致失血性休克合并內(nèi)毒素感染性休克導(dǎo)致多器官功能不全綜合征。方法如下：大耳白兔稱體質(zhì)量， 3%戊巴比妥鈉按1 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉。麻醉后，將兔仰臥位固定于加溫手術(shù)臺上，腹股溝備皮，消毒，逐層分離，充分暴露股動脈和股靜脈，游離3～4 cm股動脈。用血管夾夾閉一段動脈，在動脈上剪一小斜口，行股動脈插管，并固定導(dǎo)管，連接機能實驗轉(zhuǎn)換器，通過Rm6240BD多道生理信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測血壓、呼吸流量指標變化。初步估算血容量，一般為體質(zhì)量的5%～6%，術(shù)后10 min，以放血量為血容量的35%～40%復(fù)制失血性休克模型。股靜脈插管，將60%所失血液及2倍失血量的平衡液自股靜脈1 h內(nèi)回輸復(fù)蘇，造成復(fù)蘇再灌注損傷[1]，為導(dǎo)致MODS且不致死亡提供治療。術(shù)畢，把股動、靜脈斷端分別結(jié)扎，拔出插管。逐層縫合后放入兔籠每天進行早晚2次觀察。根據(jù)二次打擊學(xué)說[2]，術(shù)后24 h腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素10 μg/kg[3]模擬人類膿毒血癥時內(nèi)毒素釋放入血的特點，導(dǎo)致MODS。經(jīng)歷創(chuàng)傷和感染的2次打擊，使動物能對創(chuàng)傷和感染因素表現(xiàn)出器官功能由代償?shù)绞Т鷥數(shù)姆磻?yīng)過程。(3)模型移植治療組15只，手術(shù)創(chuàng)傷失血性休克合并內(nèi)毒素感染性休克導(dǎo)致MODS，進行骨髓干細胞回輸治療。術(shù)前一晚，兔禁食不禁水過夜。實驗用材料、試劑等均無菌、無熱源。

1.2臨床表現(xiàn)觀察 通過放血和回輸?shù)姆椒ㄊ寡獕壕S持40 mm Hg 1 h，體溫下降2～3 ℃，大小便失禁，血循環(huán)發(fā)生嚴重不足，皮膚紫紺。各組觀察呼吸、心率、血壓、精神狀態(tài)、肛溫、血常規(guī)、在第1、7、14、21、28天對3組抽血化驗谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)等。

1.3BMSCs的分離及培養(yǎng) 另取健康兔5只，在兔髂后上棘進行骨髓穿刺，抽取5 mL骨髓，輕搖使之充分混勻，經(jīng)洗滌、離心，制備細胞懸液，采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)分離純化的方法，選出較高純度貼壁生長的細胞，轉(zhuǎn)入37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)3～4次傳代后，形成較典型的骨髓間充質(zhì)干細胞。在模型成功制作24 h后，將體外分離、擴增、標記的BMSCs按照3×106cells/kg通過股動脈沿升主動脈至左心室進行回輸。

1.4病理檢查準備 第28天利用空氣栓塞處死正常組、模型組和模型移植治療組兔取心、肺、腎、肝、脾等器官，進行病理檢查及切片。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理，比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床表現(xiàn) 正常組兔精神好，活動如常，毛發(fā)有光澤，飲食、飲水及大便無異常，觀察期間無死亡。模型組兔癥狀、體征變化明顯，出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，結(jié)膜蒼白，口唇發(fā)紺，2 d后部分動物出現(xiàn)呼吸急促，呼吸頻率大于120次/分，雙肺伴有濕羅音，部分伴有顫抖，進食、進水明顯減少，10 d左右毛發(fā)失去光澤，部分出現(xiàn)脫落。肛溫明顯升高或下降(小于36 ℃)，體質(zhì)量下降，白細胞最初表現(xiàn)為明顯的下降，后表現(xiàn)為持續(xù)的上升，表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)的過程。觀察期間超過50%(8只)死亡。模型移植治療組經(jīng)過干細胞移植回輸治療15 d后，兔呼吸狀況得到改善，癥狀出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，雙肺羅音消失，4周后大部分動物基本恢復(fù)正常。手術(shù)后，各項生化指標(PaO2、BUN、ALT、CK-MB)升高；打內(nèi)毒素后，升高更加明顯；移植治療組第1、7天與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第14、21、28天各項生化指標明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2病理檢查

2.2.1正常組兔心、肝、脾、腎結(jié)構(gòu)清晰未見異常，部分肺稍顯充血。

2.2.2模型組兔大體檢查及鏡下改變 心臟：大體檢查，體積增大，部分心室稍肥厚。鏡下見心肌細胞水腫變性。間質(zhì)充血水腫，炎性細胞浸潤。以心內(nèi)膜下充血水腫為明顯，部分可見心內(nèi)膜分離。觀察期間死亡兔：心肌肌漿溶解或呈顆粒狀凝聚致染色分布不均，呈強嗜伊紅染色，部分橫紋模糊不清或消失，心肌出現(xiàn)大小不等的空泡，心肌凝固性壞死或液化性壞死。間質(zhì)水腫，大量炎性細胞浸潤。肺臟：雙肺大體檢查，飽滿腫脹，多有點片狀出血，有的呈灰紅色實變。鏡下：肺泡水腫，淤血，肺泡腔大量紅細胞、白細胞及細胞碎片，并見有肺實變。肺間質(zhì)水腫，炎性細胞浸潤，部分以中性粒細胞聚積為主，局部組織細胞增生，可見核分裂。毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹，紅細胞淤積，形成微血栓。觀察期間死亡兔部分肺顯著水腫、部分實變明顯。肝臟：大體檢查，肝腫脹、包膜緊張，肝實質(zhì)呈暗紅，淤血明顯，部分可見黃白色壞死灶，偶有點狀出血。鏡下：肝細胞排列紊亂,大部分細胞變性濁腫甚至空泡樣改變，可見嗜酸性變化和毛玻璃樣變性，核固縮，有細胞凋亡，部分脂肪變性，部分可見肝細胞萎縮、點狀或小片狀壞死，周圍炎性細胞浸潤。肝竇淤血擴張，門管區(qū)明顯炎性細胞浸潤，枯否細胞明顯增生。腎臟：大體檢查，腎體積增大，腫脹，呈片狀淤血性改變。鏡下：腎小球顯著淤血或缺血，部分腎小球萎縮、消失，腎小管上皮細胞濁腫，毛玻璃樣變性，部分可見上皮細胞壞死脫落，腎小管管腔變小。腎間質(zhì)充血水腫，大量炎性細胞浸潤。部分間質(zhì)彌漫性出血，大量紅細胞堆積，部分腎小管壞死鈣鹽沉積。脾臟：大體檢查呈暗紅色，鏡下檢查脾竇擴張淤血。

2.2.3模型移植治療組兔大體檢查及鏡下改變 心、肺、肝、腎、脾大體檢查無明顯變化。鏡下見心肌細胞少數(shù)水腫變性；肺部分充血，部分伴少量淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤。肝輕度淤血，肝細胞稍濁腫、少數(shù)空泡樣改變，可見單個肝細胞壞死。腎部分腎小球輕度充血、近曲小管輕度水腫；脾輕度淤血。3組兔重要器官顯微鏡下病理改變比較，見彩插Ⅰ、Ⅱ圖1～4。

3 討 論

MODS是指在嚴重感染、創(chuàng)傷、大手術(shù)及心肺復(fù)蘇后等狀態(tài)下，機體同時或相繼發(fā)生2個或2個以上器官系統(tǒng)功能衰竭的臨床綜合征。MODS一直是當今創(chuàng)傷外科和危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點課題。Friedenstein等在骨髓單核細胞體外培養(yǎng)過程中觀察到一種牢固貼壁的梭狀細胞群，并建立了貼壁培養(yǎng)法。Piersma等將這類骨髓中含有的具備自我更新能力和多向分化潛能的干細胞命名為BMSCs。目前，對于BMSCs的分離純化方法主要有密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)/篩選法、流式細胞儀分離法(FACS)和免疫磁珠分離法(MACS)。BMSCs在特定條件誘導(dǎo)下，體外培養(yǎng)BMSCs 可向成骨細胞、成軟骨細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和脂肪細胞、神經(jīng)元樣細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等分化[4-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 可在一定條件誘導(dǎo)下能跨胚層橫向分化為肝、胰島、腎小管等細胞[9-11]。

本研究通過二次打擊成功造模，MODS模型兔消化、呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)臨床癥狀明顯，并有超過50%死亡。心、肺、肝、腎等重要臟器顯著淤血、腫脹、變性壞死，肝細胞和腎小管空泡變性，部分腎小管壞死后鈣鹽沉積；肺實變，炎性細胞浸潤，通氣功能障礙。體外分離培養(yǎng)篩選純化骨髓干細胞，并成功把BMSCs移植進入模型組兔，經(jīng)BMSCs移植治療的MODS模型組兔的臨床癥狀、生化指標及病理改變明顯減輕， 14 d后PaCO2、BUN、ALT、CK-MB等項生化指標逐漸恢復(fù)正常。治療組兔逐漸好轉(zhuǎn)，消化功能正常，呼吸平穩(wěn)，大小便正常并全部存活。

關(guān)于BMSCs用于MODS治療未見報道，但有通過細胞分化、細胞融合和自分泌或旁分泌等機制治療血管病變、冠心病、腦梗死、肝損傷、腎病、肺損傷等的研究報道[12]。多項研究證實，BMSCs具有向缺血或損傷組織歸巢的特性，植入模型兔進到缺血組織后與宿主受損組織相互作用，能夠自分泌或旁分泌一系列因子，參與移植治療后的免疫調(diào)節(jié)[13]?？墒箍寡准毎蜃覫L-10、FGF-2、TNF-α和Bcl-2蛋白明顯上調(diào)，提示，BMSCs誘導(dǎo)的早期肝臟和腎臟保護可能主要是通過旁分泌的抗炎功能實現(xiàn)的[14]。通過抗凋亡，誘導(dǎo)血管生成而改善梗死心肌的功能[15]，抗炎和促進增殖及存活等效應(yīng)明顯改善缺血后心臟、肝臟及腎臟等器官功能，促進組織修復(fù)，表明對MODS的治療可能。本研究結(jié)果提示，BMSCs移植治療的MODS模型組兔是成功的，但仍需再增加病例數(shù)及觀察項目，更加細致地觀察治療過程中的改變。

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