黃國(guó)文

（湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)和化學(xué)工程系，湖南 永州 425100）

葉綠體是植物特有的細(xì)胞器，是光合作用的場(chǎng)所。1931年Kaustky和Hirsch用肉眼觀(guān)察并記錄了葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象[1]。將暗適應(yīng)的綠色植物或含有葉綠素的組織突然暴露在可見(jiàn)光下，葉綠體的熒光快速上升然后下降到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，這一現(xiàn)象稱(chēng)為Kautsky效應(yīng)。熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間變化的曲線(xiàn)稱(chēng)為葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。在普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)中開(kāi)設(shè)了綜合性的“葉綠體的分離和熒光觀(guān)察”實(shí)驗(yàn)[2]，目的是使學(xué)生了解葉綠體的制備方法和葉綠體熒光產(chǎn)生的機(jī)理，了解熒光強(qiáng)度與光合作用的關(guān)系以及葉綠體活性與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)生物現(xiàn)象的觀(guān)察和理解能力以及運(yùn)用知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的能力。但是在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)于用差速離心法制備離體葉綠體和觀(guān)察其熒光現(xiàn)象的步驟，大多數(shù)學(xué)生不能很好地和獨(dú)立地完成。本人根據(jù)這種實(shí)際情況，研究了存在這種現(xiàn)象的原因，設(shè)計(jì)了一個(gè)離體葉綠體的制備和熒光現(xiàn)象觀(guān)察的新方法—質(zhì)壁分離法分離離體葉綠體并觀(guān)察其熒光。應(yīng)用這種方法取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。

1 建立本方法的依據(jù)

1.1 葉綠體熒光現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理

當(dāng)葉綠體中葉綠素分子吸收光能（光量子）后，其中的電子由低能級(jí)（基態(tài)）激發(fā)為高能電子（激發(fā)態(tài)）。不同光質(zhì)激發(fā)的高能電子出現(xiàn)在不同的軌道中旋轉(zhuǎn)。如果葉綠素分子被藍(lán)光（430nm）激發(fā)，葉綠素中的電子躍遷到能量較高的軌道稱(chēng)為第二單線(xiàn)態(tài)；如果被紅光（670 nm）激發(fā)，電子躍遷到能量較低的軌道旋轉(zhuǎn)稱(chēng)為第一單線(xiàn)態(tài)。處于第一和第二單線(xiàn)態(tài)的電子，其自旋方向保持原來(lái)狀態(tài)，如果電子在激發(fā)或退激過(guò)程中自旋方向發(fā)生變化，該電子就進(jìn)入能級(jí)較單線(xiàn)態(tài)低的軌道稱(chēng)為三線(xiàn)態(tài)。這些高能態(tài)電子很不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，其能量可以同時(shí)向三個(gè)方面轉(zhuǎn)化[3]。一種形態(tài)是第二單線(xiàn)態(tài)的高能電子返回第一單線(xiàn)態(tài)以及第一單線(xiàn)態(tài)和三線(xiàn)態(tài)的高能電子返回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生熱量，第二種形態(tài)是第一單線(xiàn)態(tài)的高能電子會(huì)傳遞給內(nèi)囊體膜上的電子傳遞鏈參與光化學(xué)反應(yīng)和葉綠體基質(zhì)中進(jìn)行有機(jī)物合成，第三形態(tài)是第一單線(xiàn)態(tài)和三線(xiàn)態(tài)高能電子返回基態(tài)產(chǎn)生熒光和磷光。熒光的壽命很短，只有10-8- 10-10s。這三種能量形態(tài)以競(jìng)爭(zhēng)的方式出現(xiàn)，以至任何一種能量形態(tài)效率的增加會(huì)導(dǎo)致其它兩個(gè)種能量形態(tài)產(chǎn)量的減少[4]。正常條件下植物捕獲的光能主要用于光化學(xué)反應(yīng)，剩余的能量以熒光、熱耗散等方式被耗散掉[5]。葉綠素分子吸收藍(lán)光后躍遷到較高能級(jí)第二單線(xiàn)態(tài)的高能電子要返回能級(jí)較低的第一單線(xiàn)態(tài)才能用于光合作用，多余的能量也是以熱的形式耗散。因此，植物進(jìn)行光合作用時(shí)對(duì)紅光的能量利用率的高于對(duì)藍(lán)光的能量利用率。

1.2 葉綠體熒光淬滅現(xiàn)象

在葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)過(guò)程中，熒光由最高值降至穩(wěn)態(tài)，這種熒光產(chǎn)量的下降稱(chēng)為葉綠素?zé)晒獯銣纭Ｔ谌~綠體的分離過(guò)程中，在2 min內(nèi)葉綠體的熒光減少到穩(wěn)定態(tài)[6]。在有機(jī)溶劑中葉綠素的熒光產(chǎn)量大約為30%，然而在進(jìn)行光合作用的葉綠體的熒光產(chǎn)量為0.5-3%，這種現(xiàn)象也稱(chēng)為熒光淬滅。它包括光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅。光化學(xué)淬滅是指葉綠體的電子傳遞鏈處于氧化態(tài)，反應(yīng)中心開(kāi)放，會(huì)發(fā)生電子傳遞和電荷分離，形成ATP等產(chǎn)生熒光淬滅，反映出PSⅡ天線(xiàn)色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的分額和QA的氧化狀態(tài)。非光化學(xué)淬滅是指PSⅡ天線(xiàn)色素分子吸收了過(guò)量的光能不能用于光合電子傳遞而以熱耗散造成的光能產(chǎn)量降低。有機(jī)體為了免于過(guò)量光吸收的損害，產(chǎn)生了非光化學(xué)淬滅途徑。在一個(gè)光合作用驅(qū)動(dòng)的系統(tǒng)中，葉綠體的熒光淬滅提供了一個(gè)葉綠素被光激發(fā)與原初轉(zhuǎn)換反應(yīng)之間的關(guān)系[7]。所以實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，用前進(jìn)行充分光照，以保證葉綠體和葉綠素的活性。

2 質(zhì)壁分離法制備離體葉綠體的方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

生活細(xì)胞的原生質(zhì)膜是一種選擇性透過(guò)膜。當(dāng)細(xì)胞外的溶液濃度較高（高滲溶液）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水分便向外滲出，引起質(zhì)壁分離。然后鋒利的刀片將已經(jīng)發(fā)生質(zhì)壁分離的葉片切碎，一部分細(xì)胞的細(xì)胞壁被切去。將葉片放在低滲溶液時(shí)原生質(zhì)體吸水，發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原，這時(shí)原生質(zhì)體從細(xì)胞壁的破口處釋放出來(lái)。用等滲溶液(0.35 mol/L NaCl 或者0.4 mol/L蔗糖溶液)處理原生質(zhì)體，原生質(zhì)體破裂釋放出葉綠體。可以用于觀(guān)察葉綠體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和熒光現(xiàn)象。

2.2 操作步驟

① 取一片葉,用刀片在背面劃十字(注意：不要?jiǎng)澠迫~片)并且挑起下表皮。用鑷子從四個(gè)角撕去下表皮。切成0.5 ×0.5 cm2左右的小塊，轉(zhuǎn)入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的注射器中推拉幾次推桿，抽去葉片中的氣體。再轉(zhuǎn)入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的表面皿中浸泡10-20min。② 取3-4小塊葉片放入載波片上滴有幾滴0.9 mol/L NaCl溶液中，用刀片成條狀切碎。③離體葉綠體的分離： 將條狀切塊分批轉(zhuǎn)移到另外一塊載玻片滴有一滴0.35 mol/L NaCl溶液中，片刻后，用鑷子小心搗動(dòng)并去掉葉片碎塊。此時(shí)，溶液中葉肉原生質(zhì)體流出、破裂并釋放出葉綠體，蓋上蓋玻片。這時(shí)可以觀(guān)察葉綠體及其熒光。注意，在載玻片上0.35 mol/L NaCl溶液中多放些葉片碎塊應(yīng)以溶液淹沒(méi)為度。在溶液中分批轉(zhuǎn)入碎塊是為了收獲更多的葉綠體。在載玻片上滴0.9 mol/L NaCl溶液時(shí)不能過(guò)多，以覆蓋0.5 × 0.5 cm2的小塊葉片為宜，溶液過(guò)多時(shí)用吸水紙吸去一部分，以防止溶液外溢。如果想獲得完整的原生質(zhì)體，可以將②中的條狀碎塊轉(zhuǎn)移到載玻片上含有一滴0.6 mol/L NaCl溶液中即可。

2.3 本方法的優(yōu)點(diǎn)

一般情況下，制備植物葉綠體的方法是差速離心法。用這種方法分離葉綠體的操作條件要求較高。因?yàn)槿~綠體活力會(huì)隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，因此，如果在常溫下操作，應(yīng)該盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成。一般要求在0-4℃條件下完成操作步驟，使離體葉綠體活性保存時(shí)間長(zhǎng)些。但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一個(gè)班( 30 - 40人)同時(shí)進(jìn)行、離心機(jī)和熒光顯微鏡通常為多人共用, 難以做到迅速分離和觀(guān)察。此外，研磨葉片時(shí)不要用力過(guò)猛和連續(xù)研磨以及研磨過(guò)細(xì)，應(yīng)以不延續(xù)研磨和把葉片研磨成小塊為宜，在沒(méi)有進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的情況下研磨葉片時(shí)的力度和研磨次數(shù)難以掌握。研磨液需要用4層紗布過(guò)濾，濾液要經(jīng)過(guò)逐級(jí)離心才能分離出葉綠體，這樣葉綠體在體外的時(shí)間較長(zhǎng)，增加了葉綠體熒光淬滅和活性喪失的機(jī)會(huì)。一次實(shí)驗(yàn)要使用較多材料（30 g左右）來(lái)提取葉綠體，否則經(jīng)過(guò)研磨、過(guò)濾和分級(jí)離心以后得到的葉綠體的數(shù)量非常少，這樣也減少了每個(gè)學(xué)生動(dòng)手操作實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì)。

運(yùn)用質(zhì)壁分離法制備離體葉綠體，操作簡(jiǎn)單，不需要組織搗碎機(jī)和離心機(jī)等設(shè)備。所用的實(shí)驗(yàn)材料少，適合每一位同學(xué)動(dòng)手操作實(shí)驗(yàn)。制備葉綠體的步驟少，所需的時(shí)間短，可以有效保存葉綠體的活性，減少葉綠體熒光淬滅的機(jī)會(huì)，觀(guān)察到的葉綠體的熒光現(xiàn)象明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果好。

3 觀(guān)察葉綠體熒光現(xiàn)象

3.1 離體葉綠體與細(xì)胞內(nèi)的葉綠體熒光強(qiáng)度比較

將制備好的離體葉綠體裝片和葉肉裝片放在熒光顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)離體葉綠體的熒光要比細(xì)胞內(nèi)的葉綠體的要亮。這是由于離體葉綠體光合作用的光反應(yīng)受阻引起的。因?yàn)橹参锕夂献饔玫墓夥磻?yīng)在葉綠體類(lèi)囊體薄膜上進(jìn)行。葉綠素分子吸收光能，被激發(fā)出一個(gè)高能電子。這個(gè)電子則在類(lèi)囊體膜上的電子傳遞鏈傳遞下去，并將 H+質(zhì)子從葉綠體基質(zhì)泵入到類(lèi)囊體腔，建立電化學(xué)質(zhì)子梯度，用于 ATP的合成，NADP+接受高能電子被還原為NADPH。葉綠素分子由于失去一個(gè)電子，就留下一個(gè)空穴，只得從周?chē)乃肿又袏Z得電子，因而促使水的分解。由于離體葉綠體基質(zhì)中ADP+和NADP+和CO2有限，不能從細(xì)胞質(zhì)中得到補(bǔ)充，高能電子的傳遞受阻，其能量重新以熒光形式發(fā)射出來(lái)，所以其熒光強(qiáng)度較亮；在同等光照強(qiáng)度的情況下，細(xì)胞內(nèi)的葉綠體的光合作用能夠順利進(jìn)行，葉綠素分子吸收光照產(chǎn)生的激發(fā)能主要用于光合作用，葉綠素發(fā)射的熒光量子就少，其熒光強(qiáng)度就低[8]。同樣地，離體葉綠素的熒光比細(xì)胞內(nèi)的熒光要強(qiáng)。這是因?yàn)殡x體葉綠素沒(méi)有結(jié)合在葉綠體中的類(lèi)囊體上，葉綠素分子受到光能激發(fā)產(chǎn)生的高能電子的能量不能傳遞到電子傳遞鏈重新被發(fā)射出來(lái)，所以熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；然而細(xì)胞中葉綠素分子結(jié)合在類(lèi)囊體上，在同等光照強(qiáng)度的情況下葉綠素分子受到光能激發(fā)產(chǎn)生的高能電子的能量能可以傳遞到電子傳遞鏈進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，能夠被發(fā)射出來(lái)的熒光量就少，所以熒光強(qiáng)度就弱。

3.2 不同濾光片下葉綠體自發(fā)熒光的比較

在熒光顯微鏡下?lián)Q用不同濾光片觀(guān)察葉綠體裝片，可見(jiàn)葉綠體的自發(fā)熒光會(huì)發(fā)生變化，葉綠體的顏色相應(yīng)地發(fā)生改變。這是因?yàn)槿~綠體的熒光特征基本上是由吸收光的色素、激發(fā)能的轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生熒光色素的特性決定的，也受反應(yīng)中心和 PSⅡ的電子供體和電子受體的還原狀態(tài)的影響，還受溫度、光照強(qiáng)度、水分等環(huán)境因素的影響。在植物體內(nèi)由于激發(fā)能從ch1b 向ch1a 的傳遞效率幾乎達(dá)到100% , 所以PSⅠ色素系統(tǒng)基本不發(fā)熒光，檢不出體內(nèi)ch1b 的熒光。在室溫下，細(xì)胞內(nèi)和離體葉綠體的熒光幾乎都是來(lái)源于 PSⅡ的Chl a，發(fā)射的熒光產(chǎn)量和動(dòng)力學(xué)是與PSⅡ的原初光化學(xué)反應(yīng)密切相連的[9,10]。植物進(jìn)行光合作用時(shí)，葉綠體分子吸收的光主要是藍(lán)光和紅光(400-700 nm, 它被稱(chēng)為光合作用有效輻射)，然而葉綠體產(chǎn)生的熒光主要在紅光至幾乎紅外光(660-800 nm)區(qū)。葉片中葉綠素產(chǎn)生的熒光有兩個(gè)最大值：紅光區(qū)（大約686-690 nm）和遠(yuǎn)紅光區(qū)（大約730-740 nm）[11]，所以熒光是葉綠素吸收光能以后重新以光的形式發(fā)射出來(lái)的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。在介質(zhì)中沒(méi)有添加輔助因子（維生素C、維生素K13，AMP + Mg2++ FMN + TPN）的離體葉綠體的熒光誘導(dǎo)現(xiàn)象比完整葉片里的葉綠體的熒光誘導(dǎo)現(xiàn)象明顯地簡(jiǎn)單[12]。

總之，運(yùn)用質(zhì)壁分離法制備離體葉綠體和熒光觀(guān)察的方法，能夠克服用差速離心法制備葉綠體耗時(shí)、葉綠體活性難以保證等缺點(diǎn)；能夠清楚地觀(guān)察到離體葉綠體的自發(fā)熒光現(xiàn)象，也為觀(guān)察葉綠體的次生熒光現(xiàn)象打下了基礎(chǔ)。在我校生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，運(yùn)用這一方法，每一組的學(xué)生都能動(dòng)手完成實(shí)驗(yàn)，能夠制備到有活性的離體葉綠體并且清楚地觀(guān)察到熒光現(xiàn)象的學(xué)生人數(shù)達(dá)到95%以上。這一方法將會(huì)在今后的學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)教學(xué)中得到有效的應(yīng)用。

[1]Govindjee.Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence[J].Aust J Plant Physiol, 1995, 22: 131—160.

[2]彭玲主編.普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2009,p65.

[3]Rohácek K, and Barták M.Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters,and some applications[J].Photosynthetica, 1999, 37:339-363.

[4]Maxwell K, Johnson GN.Chlorophyll fluorescence - a practical guide[J].Journal of Experimenral Botany, 2000,51:659-668.

[5]Krause GH and Weis E.Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, 42: 319-349.

[6]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.

[7]Arnon DI, TsuJimoto HY, and Mcswain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphoryla tion and electron transfer[J].Biochemistry, 1965, 54:927-934.

[8]Arnon DI, Tsujimoto HY, and McSwain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphorylation and electron transfer[J].PNAS, 1965, 54:927-934.

[9]Homann PH.Cation Effects on the Fluorescence of Isolated Chloroplasts[J].Plant Physiol.1969, 44, 932-936.

[10]Oxborough K.Imaging of chlorophyll a fluorescence:Theoretical and practical aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance[J].Journal of Experimental Botany, 2004, 55: 1195- 1205.

[11]Buschmann C .Variability and application of the chlorophyll fluorescence emission ratio red/far-red of leaves[J].Photosynthesis Research, 2007,92: 261-271.

[12]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.