李原，劉文財(cái)，孫文龍，董悅生，閻浩林

·論著·

蠕蟲NADH-延胡索酸還原酶模型優(yōu)化及沃特曼內(nèi)酯F的活性評(píng)價(jià)

李原，劉文財(cái)，孫文龍，董悅生，閻浩林

目的優(yōu)化蠕蟲 NADH-延胡索酸還原酶及哺乳動(dòng)物NADH 氧化酶的高通量篩選模型，評(píng)價(jià)沃特曼內(nèi)酯 F 的活性及選擇性。

抗蠕蟲藥； 電子傳遞復(fù)合物 I； NADH 氧化酶； 沃特曼內(nèi)酯 F

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2012, 7(4):276-280

蠕蟲和哺乳動(dòng)物的呼吸能量代謝系統(tǒng)的差異是發(fā)現(xiàn)新的抗蠕蟲藥物的熱點(diǎn)[1]。蠕蟲線粒體呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)的 NADH-延胡索酸還原酶（NFRD，EC 1.3.1.6），由 complex I 和 complex II組成[2]。該酶系將電子傳遞給complex I，并經(jīng)過深紅醌傳遞給complex II，同時(shí)催化延胡索酸生成琥珀酸。而哺乳動(dòng)物不含該酶系，相對(duì)應(yīng)的酶系為NADH-氧化酶（EC 1.6.99.3），由 complex I、III 和IV 組成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 NFRD 抑制劑有nafuredin[3]，ukulactone A、B[4]等，但對(duì)蠕蟲 NFRD和哺乳動(dòng)物 NADH-氧化酶模型的條件優(yōu)化未見報(bào)道。沃特曼內(nèi)酯是本課題組從鄔氏黃絲曲霉（Talaromyces. wortmannii）F01Z0195 中分離得到一類新化合物[5-6]，與 ukulactone 類化合物結(jié)構(gòu)相近，本研究旨在優(yōu)化蠕蟲 NFRD 評(píng)價(jià)模型并評(píng)價(jià)沃特曼內(nèi)酯 F 的選擇性抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 豬蛔蟲和豬心均采自大連肉聯(lián)廠；沃特曼內(nèi)酯 F 本實(shí)驗(yàn)室自制；NaH2PO4、葡萄糖購自天津大茂化學(xué)試劑廠；NaCl、Na2HPO4·12H2O 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl、EDTA-2Na、NADH·2Na 購自中國北京Solarbio 公司；蔗糖購自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.2儀器 全波長掃描熒光酶標(biāo)儀 Varioscan Flash IX71/IX51 為美國 Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；離心機(jī) SORVALL 為德國 Biofuge Stratos 產(chǎn)品；榨汁機(jī) MSL-2008A 為成都每時(shí)樂電器有限公司產(chǎn)品；PB-10 型 pH 計(jì)為德國 Sartotius公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1線粒體提取 首先線粒體提取均在冰浴中進(jìn)行，446.3 g 豬蛔蟲用 0.15 mol/L 的 KCl 溶液浸泡，除去內(nèi)臟后的質(zhì)量為 337.8 g，用 500 ml的冰凍勻漿介質(zhì)（pH 7.40，0.01 mol/L Tris-HCl，0.0001 mmol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L 蔗糖，0.8％ NaCl 溶液）浸泡并用榨汁機(jī)榨汁成漿狀，再加入1500 ml 的冰凍勻漿介質(zhì)攪拌均勻。紗布過濾除去膜狀物質(zhì)，在 3588.8 × g、4 ℃ 條件下離心 15 min，棄去沉淀；上清液在 17944 × g、4 ℃ 條件下離心15 min，收集沉淀物棄去上清液。沉淀物即線粒體，用時(shí)加入 0.12 mol/L 的磷酸鈉溶液（pH 7.0）配制成不同濃度的線粒體。

豬心用 0.15 mol/L 的 KCl 溶液浸泡，除去結(jié)締組織，得 145.9 g 豬心肌肉，線粒體提取方法同豬蛔蟲線粒體。

1.2.2最佳反應(yīng)條件確定 蠕蟲 NFRD 最佳反應(yīng)溫度的考察實(shí)驗(yàn)，按照如下方法進(jìn)行：170 μl 磷酸鹽緩沖液（0.12 mol/L，pH 7.0）包含 0.35 mmol NADH，7.2 mmol 延胡索酸二鈉，加入 10 μl DMSO溶液，放入 96 孔板中振蕩 3 min，反應(yīng)以加入20 μl 0.125 g/ml 的線粒體液開始。分別在 34、37、40 ℃，保溫 3 min 后，在相應(yīng)溫度下，在 340 nm處每 15 秒測(cè)定一次吸光值，共 10 min。以吸光值-時(shí)間直線回歸的斜率反應(yīng) NADH 變化率。

反應(yīng)最佳 pH 值的考察實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)溫度為37 ℃ 下進(jìn)行，緩沖液 pH 值為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其余方法同上。

最適 NADH 濃度考察實(shí)驗(yàn)在 37 ℃ 下進(jìn)行，NADH 終濃度為 0.09、0.13、0.18、0.26、0.35 mmol/L，其余方法同最佳溫度考察實(shí)驗(yàn)。

最適線粒體濃度的考察實(shí)驗(yàn)在 37 ℃ 下進(jìn)行，線粒體的終濃度為 0.003、0.006、0.013、0.025、0.038、0.050 g/L，其余方法同最佳溫度考察實(shí)驗(yàn)。

豬心 NADH 氧化酶模型的優(yōu)化的參數(shù)同豬蛔蟲 NFRD 模型，也為溫度、pH、NADH 及線粒體濃度優(yōu)化參數(shù)。

1.3 活性測(cè)定

1.3.1豬蛔蟲 NADH 延胡索酸還原酶活性測(cè)定 在優(yōu)化的條件下進(jìn)行，在 37 ℃ 下，120 μl磷酸鹽緩沖液（0.12 mol/L，pH 6.5）包含由DMSO 溶解的沃特曼內(nèi)酯 F 10 μl（終濃度依次為6244.30、1248.82、249.76、49.95、9.99、2.00，0.40 和 0.08 nmol/L），0.35 mmol/L NADH 10 μl 和72 mmol/L 溶于磷酸鹽緩沖液（0.12 mol/L，pH 6.5）延胡索酸二鈉 20 μl，加入溶于 40 μl 0.125 g/ml 的豬蛔蟲線粒體液開始，在 340 nm 處每 15 秒測(cè)定吸光值，共 10 min。對(duì)照組不加入沃特曼內(nèi)酯 F 樣品，加入 10 μl DMSO 溶液；空白組不加入線粒體溶液，補(bǔ)以 40 μl 緩沖液。每個(gè)樣品做 4 個(gè)平行。

抑制率的計(jì)算公式[4]為：

抑制率（％）= [1 －(A樣品孔slope －A未加酶孔slope)/(A對(duì)照孔slope －A未加酶孔slope)] × 100，其中Aslope 為 340 nm 處吸光值的變化曲線斜率。

1.3.2豬心 NADH 氧化酶活性測(cè)定 140 μl 磷酸鹽緩沖液（0.12 mol/L，pH 6.5）包含 0.35 mmol/L NADH 10 μl，加入 10 μl DMSO 溶解的沃特曼內(nèi)酯，放入 96 孔板中振蕩 3 min，反應(yīng)以加入 40 μl 0.125 g/ml 的豬心線粒體液起始。37 ℃，340 nm 處每隔 15 秒測(cè)定一次吸光度值，共 10 min。沃特曼內(nèi)酯 F 濃度同1.3.1。對(duì)照組不加入沃特曼內(nèi)酯 F樣品，加入 10 μl DMSO 溶液；空白組不加線粒體，補(bǔ)以 40 μl 緩沖液。每個(gè)樣品做 4 個(gè)平行。抑制率計(jì)算方法同上。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)最適溫度的確定

反應(yīng)溫度對(duì)豬蛔蟲 NFRD和豬心 NADH 氧化酶模型均有影響，其中對(duì)豬蛔蟲 NFRD 模型影響更大一些，37 ℃，340 nm 的OD變化量最大（見圖 1），表明在該溫度下豬蛔蟲 NFRD 和豬心NADH 氧化酶的活性最高，并按照 34 ℃、40 ℃ 依次降低，提示 37 ℃ 為豬蛔蟲 NFRD 和豬心NADH 氧化酶模型最適溫度，條件優(yōu)化均在 37 ℃下進(jìn)行。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)豬蛔蟲 NFRD 和豬心 NADH 氧化酶模型的影響Figure 1 The influence of the temperature onAscaris suumNFRD and pig heart NADH oxidase model

2.2 豬蛔蟲 NFRD 模型的條件優(yōu)化

2.2.1pH 影響 pH 值對(duì)豬蛔蟲 NFRD 模型影響比較明顯（圖 2），pH 6.0 是 340 nm處OD變化量只有 0.005 OD/s，表明在該 pH 下，酶活性降低。隨著 pH 值提高，單位時(shí)間內(nèi)OD變化量明顯提高，其中 pH 6.5 時(shí)，OD變化達(dá)到了最大值0.02 OD/s。提示在該 pH 下酶活力最高，隨著 pH進(jìn)一步升高，在 pH 7.0、7.5、8.0 條件下，單位時(shí)間內(nèi)OD變化值依次下降，因此 pH 6.5 為反應(yīng)最適 pH 值。

2.2.2NADH 濃度影響 隨著 NADH 濃度的增加，單位時(shí)間內(nèi)OD值變化量有逐漸增大的趨勢(shì)（圖 3），在 NADH 濃度達(dá)到 0.18 mmol/L 時(shí)，OD變化值可以達(dá)到 0.02 OD/s以上，繼續(xù)增加NADH 添加量雖然可以提高OD值變化量，但此時(shí)體系OD值也增加到了 1.4 以上，易使測(cè)定產(chǎn)生偏差。為了測(cè)定的準(zhǔn)確性，并保持本模型和豬心NADH 氧化酶活性測(cè)定中的主要條件一致性，本模型選擇 0.18 mmol/L 為最優(yōu) NADH 濃度。

2.2.3線粒體濃度影響 隨著線粒體濃度的增加，OD值變化量也顯示逐漸增大趨勢(shì)（圖 4），但同時(shí)活性測(cè)定體系中的OD值也有逐漸增加的趨勢(shì)，線粒體濃度為 0.025 g/L 時(shí)，能同時(shí)保證較大的OD變化量和較低OD值，綜合考慮豬蛔蟲 NFRD 和豬心 NADH 氧化酶的結(jié)果，確定0.025 g/L 為最佳線粒體濃度。

圖2 pH 值對(duì)豬蛔蟲 NFRD 模型的影響Figure 2 The influence of pH onAscaris suumNFRD model

圖3 NADH 濃度對(duì)豬蛔蟲 NFRD 模型的影響Figure 3 The influence of NADH concentration onAscaris suumNFRD model

圖4 線粒體濃度對(duì)豬蛔蟲 NFRD 模型的影響Figure 4 The influence of mitochondrial concentration onAscaris suumNFRD model

2.3 豬心 NADH 氧化酶模型的條件優(yōu)化

2.3.1pH 影響 pH 值對(duì)豬心 NADH 氧化酶模型影響也比較明顯（圖 5），pH 6.0 時(shí)，340 nm處單位時(shí)間內(nèi)OD值變化量為 0.02 OD/s，酶活力最低；pH 6.5 時(shí)，OD值變化量達(dá)到了最大值0.035 OD/s，酶活力最高；隨著 pH 進(jìn)一步升高，在 pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0 條件下，酶活力又有所下降，但仍高于 pH 6.0 時(shí)的酶活力。因此，pH 6.5為反應(yīng)最適 pH 值。

2.3.2NADH 濃度影響 隨著 NADH 濃度的增加，單位時(shí)間內(nèi)OD值變化量有逐漸增大的趨勢(shì)（圖 6），但當(dāng)濃度達(dá)到 0.26 mmol/L 后，OD值變化又降低。在 NADH 濃度達(dá)到 0.18 mmol/L時(shí)，OD變化值可以到達(dá) 0.025 OD/s，為最高值，因此本模型選擇 0.18 mmol/L 為最優(yōu) NADH 濃度。

2.3.3線粒體濃度影響 隨著線粒體濃度的增加OD值變化量也顯示逐漸增大趨勢(shì)（圖 7），但同時(shí)活性測(cè)定體系中的OD值也有逐漸增加的趨勢(shì)，線粒體濃度為 0.025 g/L 時(shí)，能同時(shí)保證較大的OD變化量和較低OD值，確定 0.025 g/L 為最佳線粒體濃度。

圖5 pH 值對(duì)豬心 NADH 氧化酶模型的影響Figure 5 The influence of pH on pig heart NADH oxidase model

2.4 沃特曼內(nèi)酯 F 對(duì)豬蛔蟲 NFRD 和豬心 NADH氧化酶抑制活性評(píng)價(jià)

采用優(yōu)化的反應(yīng)條件分別測(cè)定了沃特曼內(nèi)酯 F 對(duì)豬蛔蟲 NFRD 和豬心NADH 氧化酶的抑制活性，在 37 ℃，pH 6.5，NADH 濃度為0.175 mmol/L，線粒體濃度為 0.025 g/L 條件下，沃特曼內(nèi)酯 F 對(duì) NFRD 的 IC50為 5.0 nmol/L（圖 8），而對(duì)于豬心 NADH 氧化酶在 6.2 μmol/L濃度下，抑制活性尚低于 50％。以上結(jié)果表明沃特曼內(nèi)酯 F 和 Ukulactone A 具有相當(dāng)?shù)囊种苹钚裕▓D 9），均到了 nmol/L 級(jí)，而對(duì)哺乳動(dòng)物相對(duì)應(yīng)的 NADH 氧化酶活性較低，是一個(gè)高活性、高選擇性的蠕蟲 NFRD 抑制劑。

圖6 NADH 濃度對(duì)豬心 NADH 氧化酶模型的影響Figure 6 The influence of NADH concentration on pig heart NADH oxidase model

圖7 線粒體濃度對(duì)豬心 NADH 氧化酶模型的影響Figure 7 The influence of mitochondrial concentration on pig heart NADH oxidase model

圖8 沃特曼內(nèi)酯 F 對(duì) NADH-延胡索酸還原酶的抑制率Figure 8 The inhibition of wortmaniilactone F on NADH-fumarate reductase

圖9 沃特曼內(nèi)酯 F 和 ukulactone A 的結(jié)構(gòu)比較Figure 9 The comparison of wortmannilactone F and ukulactone A

3 討論

蠕蟲的厭氧呼吸過程和哺乳動(dòng)物的有氧呼吸過程有明顯的區(qū)別，同為呼吸鏈重要組成酶的complex I 和 II 在蠕蟲和哺乳動(dòng)物中所起的作用有明顯的不同，在蠕蟲的厭氧呼吸過程中 NADH失去電子后成為 NAD+，產(chǎn)生的電子由 complex I傳遞給深紅醌，再由深紅醌經(jīng) complex II 傳遞給延胡索酸，延胡索酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為揮發(fā)酸類，在此過程中 complex I 為 NADH-深紅醌還原酶（NADH-rhodoquinone reductase），而 complex II 為深紅醌-延胡索酸還原酶（rhodoquinonefumarate reductase）。而在哺乳動(dòng)物的有氧呼吸過程中，主要通過三羧酸循環(huán)將琥珀酸轉(zhuǎn)化為延胡索酸，電子經(jīng) complex II 傳遞給泛醌。同時(shí) NADH失去電子后成為 NAD+，電子也通過 complex I （NADH-ubiquinone reductase）傳遞給泛醌，此過程中 complex I 為 NADH-泛醌還原酶（NADH-ubiquinone reductase），而 complex II 為琥珀酸-泛醌還原酶（succinate-ubiquinone reductase reductase）。接收了電子的泛醌再將電子經(jīng) complex III （ubiquinone-cytochorome c reductase）傳遞給細(xì)胞色素 C，細(xì)胞色素 C 再經(jīng) complex IV（cytochorome c oxidase）傳遞給 O2，O2轉(zhuǎn)化為水；ADP 轉(zhuǎn)化為 ATP，由 complex I、III、IV 組成的酶系被稱為NADH 氧化酶[4]。本研究通過比較豬蛔蟲 NFRD活性和豬心 NADH 氧化酶活性，可以反映出沃特曼內(nèi)酯 F 組分對(duì)于蠕蟲及其宿主氧化呼吸鏈中關(guān)鍵酶的選擇性，這種選擇性也是高效抗蠕蟲藥物的要求。

沃特曼內(nèi)酯 F 與 ukulactone A 都含有較為新穎的母核二氫吡喃環(huán)和氧雜二環(huán)[2.2.1]，同時(shí)兩個(gè)基團(tuán)有長鏈共軛烯鍵[5]。但研究表明 ukulactone 的兩個(gè)已知組分 A 和 B，雖然只是在 2 位羥基構(gòu)型有差別，活性則相差了 470 倍[1]，沃特曼內(nèi)酯 F 組分 2 位羥基構(gòu)型和ukulactone A 相同，以上結(jié)果表明 2 位羥基對(duì)于該類化合物的抑制蠕蟲 NFRD活性影響巨大，也為抗蠕蟲藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了依據(jù)。沃特曼內(nèi)酯類化合物具有高活性、高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，具有開發(fā)成為新型抗蠕蟲藥物的潛能，其毒性評(píng)價(jià)、體內(nèi)活性還需進(jìn)一步研究。

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The optimization of helminth NADH-fumarate reductase model and the activity evaluation of wortmannilactone F

LI Yuan, LIU Wen-cai, SUN Wen-long, DONG Yue-sheng, YAN Hao-lin

ObjectiveTo optimize high throughput screening model of ascaris suum NADH-fumarate reductase and mammal NADH oxidase, and to evaluate the activity and the selectivity of wortmannilactone F using the two models.MethodAscaris suum and pig heart mitochondria were extracted, and then the parameters of the model, such as, temperature, pH, NADH concentration, mitochondrial concentration were optimized. The inhibititory activities of wortmannilactone F against ascaris suum NADH-fumarate reductase and pig heart NADH oxidase were also investigated under these optimum conditions.ResultsThese optimum conditions in ascaris suum NADH-fumarate reductase, such as, reaction temperature, pH, the NADH and mitochondrial concentration were 37 ℃, pH 6.5, 0.180 mmol/L and 0.025 g/L, respectively. The IC50of wortmannilactone F against ascaris suum NADH-fumarate reductase was 5.0 nmol/L, while the IC50against pig heart NADH oxidase was over 6.2 μmol/L.ConclusionWortmannilactone F shows selective inhibitory effect against ascaris suum NADH-fumarate reductase with IC50at nmol level and could be expected as a potential anti-helmintic compound.

Anthelmintics; Electron transport complex I; NADH oxidase; Wortmannilactone F

s:DONG Yue-sheng, Email: yshdong@dlut.edu.cn; YAN Hao-lin, Email: haolin-yan@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.005

國家自然科學(xué)基金（81172966）；微生物藥物技術(shù)創(chuàng)新與新藥創(chuàng)制產(chǎn)學(xué)研聯(lián)盟（2010ZX09401-403）

110016 沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院（李原、閻浩林）；116024 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院（劉文財(cái)、孫文龍、董悅生）

董悅生，Email：yshdong@dlut.edu.cn；閻浩林，Email：haolin-yan@163.com

2012-04-01

方法提取豬蛔蟲和豬心線粒體，對(duì)溫度、pH、NADH 濃度和線粒體濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最適宜反應(yīng)條件。在最佳反應(yīng)條件下測(cè)定沃特曼內(nèi)酯 F對(duì)豬蛔蟲 NADH-延胡索酸還原酶和豬心 NADH 氧化酶的抑制活性。

結(jié)果豬蛔蟲 NADH-延胡索酸還原酶最佳反應(yīng)條件為37 ℃，pH 6.5，NADH 濃度為 0.18 mmol/L，線粒體濃度為0.025 g/L。沃特曼內(nèi)酯 F 的 IC50為 5.0 nmol/L；對(duì)于豬心NADH 氧化酶的 IC50大于 6.2 μmol/L。

結(jié)論沃特曼內(nèi)酯 F 是一種選擇性豬蛔蟲 NADH-延胡索酸還原酶的抑制劑，抑制活性達(dá)到了 nmol/L 級(jí)，具有成為新型抗蠕蟲藥物的潛力。

Author Affiliations:School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China (LI Yuan, YAN Hao-lin); School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China (LIU Wen-cai, SUN Wen-long, DONG Yue-sheng)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):276-280