王繼貴

(中南大學湘雅二醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410011)

腦卒中新的生物標志物研究進展

王繼貴

(中南大學湘雅二醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410011)

本綜述闡述了多種用于腦卒中危險預測和診斷的新生物標志物，包括脂蛋白有關(guān)的磷脂酶A2、不對稱的二甲基精氨酸、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、S-100β、N-甲基-D-天門冬氨酸、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白、二磷酸核苷酸激酶A等的臨床意義，及多標志物組合的意義。

腦卒中；生物標志物；診斷

歐美國家中，腦卒中的發(fā)病率和死亡率位列第三位，僅次于缺血性心臟病和癌癥。全球約有5000萬以上的腦卒中及瞬時缺血性發(fā)作(TIA)的幸存者，在隨后的5年中，五分之一隨后將復發(fā)腦卒中[1]。腦卒中影響生活質(zhì)量，有的甚至喪失勞動能力，對家庭、財政及醫(yī)療保健都產(chǎn)生巨大的負擔。

目前，腦卒中的診斷有賴于醫(yī)師的臨床檢查，并依賴影像學技術(shù)(CT或MRI)進一步地證實。近十多年來。腦卒中生物標志物的研究有很大進展，單一或多種血液生物標志物在急診環(huán)境中，對于腦卒中的診斷、分型或甚至預測初始/復發(fā)腦卒中是有價值的。本文主要介紹近十年來發(fā)展的腦卒中新標志物研究概況。

1 理想的腦卒中生物標志物應具備的條件

理想的腦卒中生物標志物應具備：(1)敏感度高，特異性好；(2)能鑒別缺血性腦卒中和出血性腦卒中；(3)梗塞后能早期且穩(wěn)定的釋放；(4)能對危險因素評價和指導治療；(5)可迅速定量測定且價廉；(6)可幫助急診醫(yī)生診斷和評估腦卒中，改善病人的預后。

2 用于腦卒中危險性預測和診斷的新生物標志物

以下介紹幾種在腦卒中生物標志物研究領域十分活躍的標志物。

2.1 脂蛋白有關(guān)的磷脂酶A2脂蛋白有關(guān)的磷脂酶 A2(Lipoprotein associated phospholipase A2，LPPLA2)是一種分子量為50kD的不依賴鈣的絲氨酸脂酶，它水解氧化磷脂，釋放炎癥前溶血卵磷脂和氧化脂肪酸[2]。LP-PLA2在富有巨噬細胞的動脈粥樣硬化損害處產(chǎn)生和表達，在進行性冠狀動脈損害時顯著上調(diào)。2005年美國FDA已批準用LPPLA2血液試驗評價冠心病和腦卒中的危險因素，在發(fā)生腦卒中時它的產(chǎn)生約增加兩倍[3]。Ballantyne等[4]研究了12762例表面健康的中年男女，測定了LP-PLA2、CRP及傳統(tǒng)的脂質(zhì)水平，評價了它們同缺血性腦卒中的關(guān)系。在追蹤觀察6年期間，鑒別出194例缺血性腦卒中，在腦卒中和對照組之間，血漿LP-PLA2平均水平具有顯著差別(分別為443和 374μg/L，P＜0.001)，而 LDL-C 水平卻無差別。 此研究中，在鑒別腦卒中危險因素時，LP-PLA2和CRP濃度是互補的。LP-PLA2水平在三分位數(shù)最高組(≥422μg/L)及 CRP＞3mg/L 的個體對缺血性腦卒中具有最高的危險性，比LP-PLA2在三分位數(shù)最低組(＜310μg/L)和 CRP＜1mg/L 的個體危險性大11倍。

目前，測定LP-PLA2的方法有活性和質(zhì)量兩個測定法，但它們之間的關(guān)聯(lián)性很差，可能與活性測定所用的基質(zhì)不同有關(guān)。無論是活性或質(zhì)量試驗，關(guān)鍵問題是檢測的標準化。

2.2 非對稱性二甲基精氨酸 甲基精氨酸的合成是通過L-精氨酸翻譯后甲基化，在蛋白水解后以游離的二甲基精氨酸釋放。非對稱性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)和對稱的二甲基精氨酸 (Symmetric dimethylarginine,SDMA)在血液、尿和CSF中均可檢出，而SDMA是無活性的。ADMA是一種有效的一氧化氮合酶的抑制劑[5]，它介導廣泛的內(nèi)皮細胞機能紊亂。因此，血漿ADMA增加，被認為是腦卒中危險性預測的一個標志物。Yoo等[6]研究了52例缺血性腦卒中和36例健康對照，用高效液層析串聯(lián)的質(zhì)譜 (LC-MS/MS)定量測定了血漿ADMA濃度。結(jié)果顯示缺血性腦卒中病人組血漿ADMA濃度顯著高于對照組(1.85±1.32μmol/L 對 0.93±0.32μmol/L，P=0.0001)。復發(fā)性腦卒中平均值為2.28μmol/L，初始腦卒中為1.46μmol/L，對照組為 0.93μmol/L，三組之間 ADMA濃度有顯著差別，P=0.0001。

ADMA是一個新的生物標志物，同心血管總的死亡率、內(nèi)皮功能紊亂和腦卒中的危險性有關(guān)，應進一步研究它在臨床應用中的有效性。

2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶-9基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)屬鋅和鈣依賴的內(nèi)肽酶家族，與細胞外基質(zhì)蛋白周轉(zhuǎn)和降解有關(guān)。在組織重建、炎癥、血管再生和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中，MMPs起著重要的作用。腦組織MMP-9的表達，通常不可檢出，但是在腦缺血時發(fā)現(xiàn)MMP-9增加，腦卒中發(fā)作后，未控制MMP的表達及活力，介導蛋白質(zhì)的水解，導致血腦屏障漏出和細胞死亡[7]。在缺血性和出血性腦卒中的病人中，血清MMP-9水平比對照組顯著增加，它也同梗塞范圍、不良的神經(jīng)病學后果以及出血變化并發(fā)癥有關(guān)[8]。Ning等[9]證實在用組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)治療的腦卒中病人中，血漿MMP-9濃度比未治療的病人顯著增高。共研究了52例缺血性腦卒中病人(其中26例用tPA治療，26例未治療)，27例為非腦卒中的對照。結(jié)果顯示：在tPA治療組，血漿MMP-9中位數(shù)為43ng/ml，未治療組為28 ng/ml，P=0.01。在給予tPA治療后，血漿MMP-9濃度可作為預測進一步出血并發(fā)癥的一個指征。MMP-9在腦卒中發(fā)病機理中可介導雙重作用，一是血腦屏障的瓦解、神經(jīng)細胞死亡及腦卒中后出血；二是在組織修復期腦再生和神經(jīng)血管重建期間的愈合作用。MMPs是一個有價值的生物標志物，腦卒中時它同MRI和神經(jīng)病學預后呈明顯相關(guān)。

2.4 S100β蛋白 S100β亦稱S100B，是一種低分子量的神經(jīng)膠質(zhì)蛋白，它屬于多基因家族鈣介導的蛋白質(zhì)。S100是指它們在100%的硫酸銨溶液中仍能溶解，亞單位(α和β)的各種聯(lián)合，構(gòu)成S100蛋白質(zhì)家族，它分為雜化型(α-β)及同型(α-α、β-β)二聚體。S100B包含有β-β及 α-β型，發(fā)現(xiàn)在腦星形膠質(zhì)細胞、周圍Schwann細胞以及神經(jīng)元外的黑素細胞、脂肪細胞和軟骨細胞中均含有大量的S100B。這個生物標志物不受溶血的影響，且異常穩(wěn)定[10]。幾項研究[11，12]已證實在急性缺血性腦卒中血清S100B濃度顯著增加，在癥狀發(fā)作后S100B分泌增加達24h，峰濃度發(fā)生在腦梗塞后前24h內(nèi)。S100B與腦卒中臨床嚴重性和梗塞區(qū)大小顯著相關(guān)，可以作為一個監(jiān)測參數(shù)。血中S100B增加對腦梗塞不是特異的，因為在其他神經(jīng)病理情況時亦出現(xiàn)增加，包括腦外傷及顱外惡性腫瘤。

2.5 N-甲基-D-天門冬氨酸受體肽及抗體 N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體典型地含4個亞單位，2個NR1和2個NR2亞單位，若NR2降解為NR2A和NR2B肽，考慮有腦缺血或神經(jīng)毒性發(fā)生。NMDA受體抗體(NR2Abs)的產(chǎn)生，由缺血事件發(fā)生后的免疫系統(tǒng)介導，產(chǎn)生抗腦特異抗原的自身抗體，無論是這些自身抗體或NR2肽碎片本身，在CSF和血中都能定量。

Dambinova等[13]在105例腦卒中和瞬時缺血發(fā)作(TIA)病人[其中急性缺血性腦卒中(IS)31例，TIA56例，腦內(nèi)出血(ICH)18例]及255例對照中用ELISA法測定了抗-NR2A/2B自身抗體水平，以評價它對TIA、IS和ICH的鑒別能力。結(jié)果顯示：TIA和IS病人組NR2A/2B抗體水平顯著升高，與對照比較P＜0.0001；但是不能用抗體濃度區(qū)分IS與TIA。在ICH病人組及對照組中，NR2Abs不增加，提示NR2Abs陰性結(jié)果不排除ICH。在癥狀發(fā)作3h內(nèi)，用界值≥2.0μg/L時，對IS或TIA的診斷敏感度為97%，特異性98%，對IS陽性預測值為86%，TIA為 91%，陰性預測值 IS和 TIA均為98%。在急診環(huán)境中，NR2Abs水平對于幫助急性IS的診斷是有用的。Bokesch等[14]在557例經(jīng)受心腦手術(shù)的病人中，評價了NR2Ab濃度預測不利的神經(jīng)病并發(fā)癥的能力，其中僅25例病人術(shù)前NR2Ab濃度≥2.0ng/ml，但是這25例病人中有24例在術(shù)后48h內(nèi)進展發(fā)生了神經(jīng)病學并發(fā)癥，相對危險因素RR為17.9，95%CI 11.6～27.6。因此，在高危個體中，NR2Ab對于預測神經(jīng)病學事件可能是有用的。

2.6 神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)是一種單體絲狀蛋白，對腦星形膠質(zhì)細胞是特異的，作為細胞支架蛋白家族，GFAP在調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞運動和形狀方面起著重要的作用。在高等脊椎動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，由于外傷、疾病、遺傳病或化學侵蝕，星形膠質(zhì)細胞以典型的方式作出反應，產(chǎn)生膠質(zhì)細胞增生，迅速合成GFAP[15]。Foerch等[16]研究了在癥狀發(fā)作后6h內(nèi)住院的腦卒中病人，根據(jù)CT或MRI診斷ICH42例，IS93例，住院后立即采血用自動酶免疫試驗檢測GFAP。結(jié)果顯示：ICH病人組有34例檢出GFAP(占81%)，中位數(shù)11ng/L，IS病人組僅有 5例(占 5%)檢出 GFAP，中位數(shù)0ng/L，P＜0.001。在界值為2.9 ng/L時，用于鑒別ICH和IS，GFAP的診斷敏感度為79%，特異性為98%，P＜0.001。在腦卒中急性期，GFAP能可靠地鑒別ICH。Dvorak等[17]的研究證實：在腦卒中發(fā)作后2～6h之間的時間窗檢測GFAP，能最好地鑒別ICH和IS，＜2h檢測ICH的敏感度是很低的。Unden等[18]在97例腦卒中病人中，評價了S100B、神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、GFAP及活化蛋白C-蛋白C抑制劑復合物 (APC-PCI)鑒別ICH和IS的能力，證實GFAP有顯著的能力鑒別 ICH和 IS，P=0.005；而S100B(P=0.13)、NSE(P=0.67)及 APC-PCI(P=0.84)則否。而聯(lián)合GFAP和APC-PCI，能迅速地排除ICH，且在神經(jīng)影像檢查之前，能較早地啟動tPA治療。

2.7 PARK7 PARK7也稱之為DJ-1基因，開始是作為一種致癌基因發(fā)現(xiàn)的，它編碼一種普遍存在的高度保守的蛋白質(zhì)，后來被認識是常染色體隱性基因，同帕金森(Parkinson)病有關(guān)[19]。DJ-1蛋白質(zhì)的功能仍不清楚，但是有證據(jù)提示，它參與氧化應激反應，DJ-1功能喪失導致神經(jīng)退行性變，闡明DJ-1蛋白的生理作用，有助于了解腦神經(jīng)元維持神經(jīng)退行性變的機制及帕金森病的發(fā)病機理。Lescuyer等[20]用蛋白質(zhì)組學技術(shù)自一組死后病人的CSF蛋白中鑒定出PARK7，與死前CSF比較，顯著增加，隨后Allard等[21]用ELISA法測定了622例腦卒中病人和165例正常對照組血漿中PARK7水平，證實在腦卒中發(fā)作后30min至3h內(nèi)，PARK7水平顯著增加。與對照比較P＜0.001。用PARK7界值14.1μg/L時，對腦卒中的診斷敏感度為54%，特異性90%，PARK7增加不能準確地區(qū)分腦卒中的類型(IS、ICH及TIA)。因此，若測定結(jié)果增加，沒有進一步的影像學檢查，不能啟動tPA治療。

2.8 二磷酸核苷激酶A 二磷酸核苷激酶A(Nucleoside diphosphate kinase A,NDKA)，此酶負責催化各種核苷二磷酸之間磷酸鹽的交換，NDKA在各種神經(jīng)元中表達，被認為是腦卒中后涉及在缺血瀑布中，NDKA同PARK7一起被鑒定和研究[20]。由相同的研究組[21]用ELISA法研究了血漿NDKA水平，在腦卒中癥狀發(fā)作后其濃度增加稍早，診斷敏感度為67%，特異性為90%，有望在多標志物組合板中，參與腦卒中的診斷應用。

3 多標志物組合板的作用

為了改善單個生物標志物對腦卒中診斷的敏感度和特異性，發(fā)展了多標志物組合板，它對臨床診斷可提供額外的信息，且可迅速得到結(jié)果，所需儀器容易使用，且價格可取。除上述介紹的生物標志物外，還可與以前報導過的試驗組合，這些試驗對腦卒中診斷特異性較低，但聯(lián)合使用后，在腦卒中診斷、預后或?qū)淼闹委熤锌赡芷鹨恍┳饔谩Ｒ郧坝眠^的一些標志物，大致有以下幾種[22]：(1)炎癥標志物，屬先天免疫反應的一部份，如：CRP、血管細胞黏附分子 (VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)。(2)血脂異常/內(nèi)皮損傷標志物，如：ApoC1、ApoC3、腦鈉尿肽 (BNP)脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)。(3)生長因子標志物：來自腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。(4)內(nèi)皮損傷標志物：髓磷脂堿性蛋白(MBP)、神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)。 (5)血凝/纖溶標志物：D-二聚體、von Willebrand因子。此外，還有脂聯(lián)素[23]和同型半胱氨酸[24]也有報告用于腦卒中的臨床評價。

Reynolds等[25]用一種多標志物組合板，其中包含 有 S100B、BDNF、von Willebrand 因子 、MMP-9及MCP-1五個標志物，研究了223例腦卒中病人(其中82例診斷為急性缺血性腦卒中)，214例健康對照，自癥狀發(fā)作后6h內(nèi)采集血液樣本。結(jié)果揭示：聯(lián)合上述5個標志物，對急性缺血性腦卒中的診斷敏感度為92%，特異性為93%。這種多標志物組合板，在急診環(huán)境中，用于診斷急性缺血性腦卒中，對于CT掃描可以提供有效的輔助。Lynch等[26]報告用一種26個標志物的組合板研究了65例疑有缺血性腦卒中的病人，157例健康對照。結(jié)果用單變量對數(shù)分析揭示有4個標志物同腦卒中高度相關(guān)，P＜0.001。 當將 S100B、MMP-9、VCAM-1 及von Willebrand因子聯(lián)合使用時，對缺血性腦卒中的診斷敏感度和特異性均為90%，認為這種以血液為基礎的生化標志物，在鑒別急性腦缺血性腦卒中時可能是有用的。

4 展望

上面討論了幾種新的生物標志物，以及多標志物組合板，在腦卒中診斷、危險性分層及預后中的作用。那些敏感度高、特異性好的生物標志物有希望逐漸引進到臨床試驗室，以提高臨床診斷效力。當前的主要問題，除繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)新的理想的腦卒中生物標志物外，對于已研究過的有效標志物，應發(fā)展成POCT試驗(Point-of-care testing，床旁試驗)，使在急診環(huán)境中，能在30～60min內(nèi)得出檢驗結(jié)果，這樣可大大改善病人的診療效果。在發(fā)展POCT試驗的過程中，應注意檢測的標準化，使不同廠商的產(chǎn)品具有可比性，避免對臨床診療工作帶來混亂。

[1]Lioyd-Jones D,Adams R,Carnethon M,et al.Heart disease and stroke statistics-2009 update:a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee[J].Circulation,2009,119(3):e21-e181.

[2]Davidson MH,Corson MA,Alberts MT,et al.Consensus panel recommendation for incorporating lipoprotein-associated phospholipase A2 testing into cardiovascular disease risk assessment guidelines[J].Am J Cardiol 2008,101(12A):51F-57F.

[3]Gorelick PB.Lipoprotein-associated phospholipase A2 and risk of stroke[J].Am J Cardiol 2008,101(12A),34F-40F.

[4]Ballantyne CM,Hoogeveen RC,Bang H,et al.Lipoprotein-associated phospholipase A2,high-sensitivity C-reactive protein,and risk for incident ischemic stroke in middle-aged men and women in the Atherosclerosis Risk in Communities(ARIC)study[J].Arch Intern Med 2005,165(21):2479-2484.

[5]Kieistein JT,Bode-Boger SM,Frolich JC,et al,Asymmetric dimethylarginine,blood pressure,and renal perfusion in elderly subjects[J].Circulation 2003,107(14):1891-1895.

[6]Yoo JH,Lee SC.Elevated levels of plasma homocysteine and asymmetric dimethylarginine in elderly patients with stroke[J].Atherosclerosis 2001,158(2):425-430.

[7]del Zoppo GL.Stroke and neurovascular protection[J].N Engl J Med.2006,354(6):553-555.

[8]Vukasovic I,Tesija-Kuna A,Topic E,et al.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in different acute stroke subtypes[J].Clin Chem Lab Med.2006,44(4):428-434.

[9]Ning M,Furie KL,Koroshetz WJ,et al.Association between tPA therapy and raised early matrix metalloproteinase-9 in acute stroke[J].Neurology 2006,66(10):1550-1555.

[10]Kanner AA,Marchi N,Fazio V,et al.Serum S100beta:a noninvasive marker of blood-brain barrier function and brain lesions[J].Cancer 2003,97(11):2806-2813.

[11]Wunderlich MT,Wallesch CW,Gonertler M.Release of neurobiochemical markers of brain damage is related to the neurovascular status on admission and the site of arterial occlusion in acute ischemic stroke[J].J Neurol Sci 2004,227(1):49-53.

[12]Jauch EC,Lindsell C,Broderick J,et al.Association of serial biochemical markers with acute ischemic stroke:the National Institute of Neurological Disorders and Strok recombinant tissue plasminogen activator stroke study[J].Stoke 2006,37(10):2508-2513.

[13]Dambinova SA,Khounteev GA,Izykenova GA,et al.Blood test detecting autoantibodies to N-methyl-D-aspartate neuroreceptors for evaluation of patients with transient ischemic attack and stroke[J].Clin Chem 2003,49(10):1752-1762.

[14]Bokesch PM,Izykenova GA,Justice JB,et al.NMDA receptor antibodies predict adverse neurological outcome after cardiac surgery in high-risk patients[J].Stroke 2006,37(6):1432-1436.

[15]Eng LF,Ghirnikar RS,Lee YL,et al.Glial fibrillary acidic protein:GFAP thirty-one yers(1969-2000)[J].neurochem Res 2000,25(9-10):1439-1451.

[16]Foerch C,Curdt I,Yan B,et al.Serum glial fibrillary acidic protein as a biomarker for intracerebral haemorrhage in patients with acute stroke[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry 2006,77(2):181-184.

[17]Dvorak F,Haberer I,Sitzer M,et al.Characterisation of the diagnostic window of serum glial fibrillary acidic protein for the differentiation of intracerebral haemorrhage and ischaemic stroke[J]Cerebrovasc Dis 2009,27(1):37-41.

[18]Unden J,Strandbeg k,Malm J,et al.Explorative investigation of biomarkers of brain damage and coagulation system activation in clincal stroke differentiation[J].J Neurol 2009,256(1):72-77.

[19]Bonifati V,Rizzu P,van Baren MJ,et al.Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism[J].Science 2003,299(5604):256-259.

[20]Lescuyer P,Allard L,Zimmermann-Ivol CG,et al.Identification of post-mortem cerebrospinal fluid proteins as potential biomarkers of ischemia and neurodegeneration [J].Proteomic 2004,4(8):2234-2241.

[21]Allard L,Burkhard PR,Lescuyer P,et al.PARK 7and nucleoside diphosphate kinase A as plasma markers for the early diagnosis ofstroke[J].Clin Chem 2005,51(1):2043-2051.

[22]Saenger AK,Christnson RH.Stroke biomarkers:progress and challenges for diagnosis,prognosis.differentiation,and treatment[J].Clin Chem 2010,56(1):21-33.

[23]高春彪.腦梗死患者血清脂聯(lián)素測定的臨床應用[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2011，29(2)：179.

[24]肖九長，楊小燕，張榮山.83例腦梗死患者血清同型半胱氨酸水平分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2010，28(6)：623.

[25]Reynolds MA,Kirchick HJ,Dahlen JR,et al.Eraly biomarkers of stroke[J].Clin Chem 2003，49(10):1733-1739.

[26]Lynch JR,Blessing R,White WD,et al.Novel diagnostic test for acute stroke[J].Stroke 2004，35(1):57-63.

Progress of research for new biomarkers in stroke

WANG Jigui.The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410011,China

This review elaborates on new biomarkers for risk prediction and diagnosis of stroke including lipoprotein associated phospholipase A2,asymmetric dimethylarginine,matrix metalloproteinases-9,S-100β,N-methyl-D-aspartic,glial fibrillary acidic protein and neucleoside diphosphate kinase A.It also elucidates roles of multimarker panels.There is a clear need for further development and translational research in this area.

Stroke;Biomarkers;Diagnosis

R743.32

A

1674-1129(2012)04-0323-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.001

王繼貴，男，1937年9月出生，原湘雅二醫(yī)院檢驗科主任，主任檢驗師，臨床生化專業(yè)