蘇炳男,彭明婷
(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院 衛(wèi)生部北京醫(yī)院 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心,北京 100730)
造血干細(xì)胞移植因其操作簡便,能快速重建造血和腫瘤細(xì)胞污染發(fā)生較少等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于治療多種惡性血液系統(tǒng)疾病、實(shí)體腫瘤、遺傳性疾病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病等頑疾[1]。移植物中和患者體內(nèi)的造血干細(xì)胞數(shù)量對造血干細(xì)胞移植有重要的臨床意義,如決定造血干細(xì)胞的最佳采集時(shí)機(jī)、評判采集效果以及預(yù)測移植成功率等[2,3]。
早期一般使用檢測粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)的方法來間接反映移植物中的造血干細(xì)胞數(shù)量及增殖能力。但是其結(jié)果變異性大,耗時(shí)長(至少14d),不利于臨床應(yīng)用[1];單克隆抗體結(jié)合流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞具有檢測快速、結(jié)果定量并可同時(shí)檢測CD34+細(xì)胞亞群等特點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。Bittencourt等人研究發(fā)現(xiàn),移植物中CD34+細(xì)胞數(shù)大于3×106/kg的患者與小于3×106/kg的患者相比較,其移植相關(guān)累計(jì)死亡率低(19% vs.37%),術(shù)后存活率高(64% vs.40%)[2]。而且,保證移植物中足夠的CD34+細(xì)胞數(shù)量還可以降低醫(yī)療花費(fèi)。一項(xiàng)對1317份外周血采集物的調(diào)查研究顯示,移植物中CD34+細(xì)胞數(shù)大于5×106CD34+/kg的患者與小于5×106CD34+/kg的患者相比較,其平均住院時(shí)間短,抗生素、抗菌素和重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF)的平均使用量少,平均輸血次數(shù)少,因此每名患者平均可節(jié)省約3726 美金的醫(yī)療花費(fèi)[3]。
因送檢的標(biāo)本中CD34+細(xì)胞的數(shù)量非常少(0.1~3%),且流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞過程中對結(jié)果產(chǎn)生影響的因素較多,各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果存在很大的變異性。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心在2007年進(jìn)行的流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞室間質(zhì)量評價(jià)項(xiàng)目的結(jié)果顯示,35家實(shí)驗(yàn)室的相對計(jì)數(shù)結(jié)果變異性約為30%,絕對計(jì)數(shù)結(jié)果變異性約為50%。多篇國外文獻(xiàn)顯示,影響流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞結(jié)果的主要影響因素有:分析方法、實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)、檢測設(shè)備、抗體及熒光素和標(biāo)本處理過程[4-12],控制這些影響因素可以有效地降低結(jié)果變異性。本文將對這些影響因素逐一闡述,并嘗試探討質(zhì)量控制方法及規(guī)范的檢測程序。
1.1 單/雙平臺法 雙平臺法絕對計(jì)數(shù)結(jié)果的變異性要比單平臺法的變異性大[4-7]。雙平臺法絕對計(jì)數(shù)結(jié)果來源于流式細(xì)胞儀和血細(xì)胞分析儀:流式細(xì)胞儀獲取CD34+細(xì)胞百分率,血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞(有核細(xì)胞)絕對濃度,這兩個(gè)結(jié)果相乘所得即為CD34+細(xì)胞絕對濃度;單平臺法絕對計(jì)數(shù)結(jié)果僅靠流式細(xì)胞儀即可獲得:CD34+細(xì)胞的絕對濃度可以間接地通過加入的已知濃度的熒光微球數(shù)來計(jì)算。Sutherland等人的研究顯示,單平臺法避開了計(jì)數(shù)結(jié)果中分母(有核細(xì)胞總數(shù))的影響,即不受血液分析儀結(jié)果變異性的影響,所以其CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果變異性較小[8]。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2007年對國內(nèi)107家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的調(diào)查顯示,僅有10家實(shí)驗(yàn)室使用了單平臺計(jì)數(shù)法。這可能是室間質(zhì)量評價(jià)絕對計(jì)數(shù)結(jié)果變異性大于相對計(jì)數(shù)結(jié)果變異性的主要原因。盡管單平臺法成本較高,對檢測人員要求較高,但使用單平臺法計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞可以更有效地降低實(shí)驗(yàn)室間絕對計(jì)數(shù)結(jié)果的變異性[7]。
1.2 分析方案 目前大多實(shí)驗(yàn)室使用的是在國際上被認(rèn)為最具準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的ISHAGE 方案。Sutherland 于1994年在他的研究中使用這種方法進(jìn)行分析,隨后這種方法被ISHAGE(International Society for Hematotherapy and Graft Engineering)收錄作為推薦方案使用,旨在確立一個(gè)普遍通用的,可有效排除實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或?qū)嶒?yàn)室間差異的方案。該方案通過邏輯設(shè)門的方法排除干擾細(xì)胞,精確有效地計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞[9]。研究顯示,相比于ISHAGE方案,其他分析方案獲得的計(jì)數(shù)結(jié)果較低。例如,Milan 方案通過FSC和SSC 雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門來確定作為分母的白細(xì)胞數(shù)。但是較低的FSC 閾值不能完全排除碎片、紅細(xì)胞和血小板,造成結(jié)果的分母偏大。而且該方案僅分析CD34 強(qiáng)陽性細(xì)胞,不分析弱陽性細(xì)胞,這也是造成該方案得到的計(jì)數(shù)結(jié)果較低的原因[5]。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2007年對國內(nèi)107家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的調(diào)查顯示,僅有57家實(shí)驗(yàn)室使用了ISHAGE 方案計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞;而根據(jù)英國國家實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評價(jià)機(jī)構(gòu)(United Kingdom National External Quality Assessment Service,UK NEQAS) 對101家實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查顯示,有80%的被調(diào)查實(shí)驗(yàn)室都選用ISHAGE 方案,但是這些實(shí)驗(yàn)室并不都能夠正確地使用該方案分析標(biāo)本:其中僅有57%的實(shí)驗(yàn)室在分析過程中正確無誤地使用了該方案,其余的實(shí)驗(yàn)室在使用該方案時(shí)都出現(xiàn)了一些錯(cuò)誤,比如漏門、門的設(shè)置有誤等[10]。推廣并正確地使用ISHAGE 方案是提高我國實(shí)驗(yàn)室計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性的重要措施。
實(shí)驗(yàn)室檢測人員的技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)會對CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響。Guttridge等人的研究發(fā)現(xiàn),技術(shù)熟練,經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測人員可以準(zhǔn)確地移取試劑和標(biāo)本,所以能夠得到更加準(zhǔn)確且穩(wěn)定的CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果[11-13]。Levering等人對不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),一些實(shí)驗(yàn)室很少,甚至不參加權(quán)威機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量改進(jìn)項(xiàng)目,導(dǎo)致檢測人員經(jīng)驗(yàn)不足,計(jì)數(shù)結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)室差異較大[7]。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2007年對107家實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查顯示,盡管有90余家實(shí)驗(yàn)室表示參加過設(shè)備廠家組織的培訓(xùn),但由于設(shè)備、試劑及培訓(xùn)人員水平不同,廠家培訓(xùn)并不規(guī)范。我國目前也沒有權(quán)威機(jī)構(gòu)開展該項(xiàng)目規(guī)范統(tǒng)一的培訓(xùn)。為保證計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性,臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該參加權(quán)威機(jī)構(gòu)開展的室間質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量改進(jìn)項(xiàng)目,權(quán)威機(jī)構(gòu)應(yīng)開展此項(xiàng)目規(guī)范統(tǒng)一的培訓(xùn),提高檢測人員技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)。
不同品牌、不同型號的流式細(xì)胞儀得出的檢測結(jié)果有差異。2007年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心對107家實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查顯示,有54家實(shí)驗(yàn)室使用FACSCaliburTM,31家實(shí)驗(yàn)室使用Epixs XLTM,18家實(shí)驗(yàn)室使用FACScanTM,5家實(shí)驗(yàn)室使用CytoronTM。Wilfried等人的研究顯示,與FACScanTM和Epixs XLTM這2種流式細(xì)胞儀相比,F(xiàn)ACSCaliburTM和CytoronTM獲得的相對和絕對計(jì)數(shù)結(jié)果均較高,但CytoronTM的結(jié)果變異性大[7]。任何一臺流式細(xì)胞儀,保證其穩(wěn)定的狀態(tài)及合適的參數(shù),是獲得準(zhǔn)確計(jì)數(shù)結(jié)果的前提。應(yīng)使用熒光微球監(jiān)控流式細(xì)胞儀光路和液路的性能及狀態(tài),并設(shè)定合適的參數(shù)靶值范圍。在計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞前,要使用FITC/PE熒光微球調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償。設(shè)置好相關(guān)條件后,使用造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)質(zhì)控物來驗(yàn)證熒光補(bǔ)償是否合適,并調(diào)節(jié)電壓。在接受調(diào)查的107家實(shí)驗(yàn)室中有17家沒有使用光路流路校準(zhǔn)品、PMT 電壓校準(zhǔn)品以及顏色補(bǔ)償校準(zhǔn)品。而且由于進(jìn)口造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)質(zhì)控品價(jià)格昂貴,有效期短,國內(nèi)沒有相關(guān)質(zhì)控品,有9家實(shí)驗(yàn)室沒有使用質(zhì)控品。使用流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)品及造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)質(zhì)控品,保證流式細(xì)胞儀性能和狀態(tài),是獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定的CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的重要前提。
4.1 抗體 不同的抗CD34 抗體得到的CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果也不同。根據(jù)結(jié)合的CD34 抗原位點(diǎn)的不同,抗CD34 抗體可以分為三類。結(jié)合I 類抗原位點(diǎn)的抗體在與熒光素結(jié)合后,其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,抗體失去活性,特異性也會嚴(yán)重下降。而PE 標(biāo)記的針對Ⅱ類抗原位點(diǎn)的抗體能夠檢測標(biāo)本中所有CD34+細(xì)胞,但它一旦與FITC 結(jié)合后也會喪失一部分結(jié)合能力?,F(xiàn)普遍推廣使用與III 類位點(diǎn)結(jié)合的抗體,這類抗體能有效地與多種熒光素結(jié)合,如FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5,而且能夠檢測標(biāo)本中所有的CD34+細(xì)胞[7]。
4.2 熒光素 抗體結(jié)合的熒光素會對CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響。PE 熒光素是目前使用最廣泛的與抗CD34 抗體結(jié)合的熒光素。與FITC 標(biāo)記的抗體相比,無論是絕對計(jì)數(shù)還是相對計(jì)數(shù),使用PE結(jié)合的抗體得到的結(jié)果明顯更高。Levering等人的研究顯示,其原因是PE 有更強(qiáng)的熒光信號,可以更好的區(qū)分陽性和陰性細(xì)胞[7]。所以使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞的最理想熒光素為PE 標(biāo)記的抗體。
5.1 標(biāo)本保存溫度和時(shí)間 標(biāo)本的保存溫度和時(shí)間對標(biāo)本細(xì)胞狀態(tài)有影響,進(jìn)而影響CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。Gutensohn等人就保存溫度對標(biāo)本的影響的研究發(fā)現(xiàn),外周血采集物在室溫條件下保存超過24h 后,CD34+細(xì)胞數(shù)量下降了約1/4;而在4℃條件下保存的標(biāo)本,CD34+細(xì)胞數(shù)量沒有明顯下降[14]。Szolomicka-Kurzawa 就保存時(shí)間對臍帶血的影響的研究發(fā)現(xiàn),4℃條件下保存的臍帶血在離開人體內(nèi)環(huán)境的24h 內(nèi),其CD34+細(xì)胞數(shù)目和狀態(tài)可保持穩(wěn)定,增殖能力良好,而48h 以后其細(xì)胞狀態(tài)及增值能力明顯下降[15]。在美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的流式細(xì)胞儀分析計(jì)數(shù)操作指南文件中,對不同類型抗凝劑/保存液保存的新鮮標(biāo)本可以保證計(jì)數(shù)準(zhǔn)確可靠的時(shí)間進(jìn)行了說明:EDTA 保存的標(biāo)本要在12~24h 之內(nèi)分析計(jì)數(shù),肝素和ACD 保存的標(biāo)本要在48~72h 之內(nèi)分析計(jì)數(shù)[16]。實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后,為保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,應(yīng)立即進(jìn)行檢測;若不能及時(shí)檢測,需將標(biāo)本置于4℃條件下保存,并在CLSI 文件推薦的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測。
5.2 溶血素 不同種類的溶血素對流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD34+細(xì)胞結(jié)果會造成影響。根據(jù)Bossuyt等人的研究發(fā)現(xiàn),6種不同的溶血素 (①FACS Lysing Solution; ②Immunolyse Leucocyte Preparation System; ③ImmunoPrep Leucocyte Preparation System;④Optilyse B Lysing Solution;⑤Ortho-mune Lysing Reagent; ⑥ACK Lysing Buffer.)的效果各不相同。雖然所有的這些溶血素都能使CD34 陽性細(xì)胞明顯地與陰性群體區(qū)分開,但是使用Ortho-mune Lysing Reagent和ACK Lysing Buffer 兩種溶血素得到的結(jié)果大約要比使用其它溶血劑的結(jié)果高10%[17-19]。
5.3 標(biāo)本是否洗滌 溶血后不洗滌的標(biāo)本與溶血后洗滌的標(biāo)本相比,其CD34+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)結(jié)果更高。Levering等人的研究發(fā)現(xiàn),標(biāo)本中CD34+細(xì)胞數(shù)量一般很少,洗滌會導(dǎo)致細(xì)胞丟失,對結(jié)果有很大的影響。而不洗滌的標(biāo)本中較多的細(xì)胞碎片、雜質(zhì),可以通過合理的設(shè)門來排除[7]。
保證造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性十分重要,但該項(xiàng)目影響因素較多,結(jié)果變異性較大。使用單平臺ISHAGE 方案進(jìn)行檢測分析是最有效的降低結(jié)果變異性的方法。其次,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極參加權(quán)威機(jī)構(gòu)開展的室間質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量改進(jìn)項(xiàng)目,保證儀器性能狀態(tài),提高檢測人員技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)。另外,檢測時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制使用的試劑及標(biāo)本處理過程。
[1]劉艷榮,陳珊珊,于 弘.流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)CD34 陽性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2000,08(04):302-306.
[2]Bittencourt H,Rocha V,Chevret S,et al.Association of CD34 cell dose with hematopoietic recovery,infections,and other outcomes after HLA-identical sibling bone marrow transplantation[J].Blood,2002,99(8):2726-2733.
[3]Schulman KA,Birch R,Zhen B,et al.Effect of CD34 (+) cell dose on resource utilization in patients after high-dose chemotherapy with peripheral-blood stem-cell support[J].J Clin Oncol,1999,17(4):1227.
[4]Barnett D,Granger V,Storie I,et al.Quality assessment of CD34+stem cell enumeration:experience of the United Kingdom National External Quality Assessment Scheme (UK NEQAS) using a unique stable whole blood preparation [J].Br J Haematol,1998,102(2):553-565.
[5]Gratama JW,Kraan J,Keeney M,et al.Validation of the singleplatform ISHAGE method for CD34 (+) hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study[J].Cytotherapy,2003,5(1):55-65.
[6]Chang A,Raik E,Marsden K,et al.Australasian CD34+ quality assurance program and rationale for the clinical utility of the single-platform method for CD34+ cell enumeration [J].Cytotherapy,2004,6(1):50-61.
[7]Levering WH,Preijers FW,van Wieringen WN,et al.Flow cytometric CD34+ stem cell enumeration:lessons from nine years' external quality assessment within the Benelux countries[J].Cytometry B Clin Cytom,2007,72(3):178-188.
[8]Sutherland DR,Keeney M,Gratama JW.Enumeration of CD34+hematopoietic stem and progenitor cells [J].Curr Protoc Cytom,2003,Chapter 6:Unit 64.
[9]Sutherland DR,Anderson L,Keeney M,et al.The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry.International Society of Hematotherapy and Graft Engineering [J].J Hematother,1996,5(3):213-226.
[10]Whitby A,Whitby L,Fletcher M,et al.ISHAGE protocol:Are we doing it correctly? [J].Cytometry B Clin Cytom,2012,82(1):9-17.
[11]Guttridge MG,Belfield H,Hollyman D,et al.An internal positive control for the enumeration of CD45(+) and CD34(+) cells by flow cytometry allows monitoring of reagent and operator performance[J].Cytotherapy,2007,9(3):275-282.
[12]Barnett D,Janossy G,Lubenko A,et al.Guideline for the flow cy-tometric enumeration of CD34+ haematopoietic stem cells.Prepared by the CD34+ haematopoietic stem cell working party.General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology [J].Clin Lab Haematol,1999,21 (5):301-308.
[13]Brando B,Barnett D,Janossy G,et al.Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood.European Working Group on Clinical Cell Analysis [J].Cytometry,2000,42(6):327-346.
[14]Gutensohn K,Hummel K,Sputtek A,et al.Storage of peripheral blood stem cell samples alters flow cytometric CD34+ results[J].Beitr Infusionsther Transfusionsmed,1996,33:170-174.
[15]梁雪云,薛麗娜,王國平,等.臍血采集后分離時(shí)間對單個(gè)核細(xì)胞玻璃化冷凍效果的影響[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(05):464-465.
[16]Gratama JW.Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry:Approved Guideline.PA USA,2007,Clinical & Laboratory Standards Institute(CLSI).
[17]Bossuyt X,Marti GE,Fleisher TA.Comparative analysis of whole blood lysis methods for flow cytometry [J].Cytometry,1997,30(3):124-133.
[18]劉 川,鄒葉青,賀文鳳,等.造血干細(xì)胞移植供受者HLA 基因配型結(jié)果分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,27(2):137.
[19]王大光,楊曉楓.Sysmex XE-2100 血液分析儀外周血造血干細(xì)胞檢測與CD34+流式細(xì)胞儀檢測的相關(guān)性[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,27(2):199-200.