吳 峰，王國坤，倪飛華，馮金忠，邱一華，李 嘉，張海峰，高 峰，秦永文

(1第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海200433;2第四軍醫(yī)大學(xué); 3解放軍第九八醫(yī)院)

心肌梗死與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，缺血/再灌注(MI/R)后心肌組織可出現(xiàn)較前損傷加重的情況，目前研究認(rèn)為可能是循環(huán)血中的中性粒細(xì)胞(PMN)向血管內(nèi)皮黏附，并最終遷移和聚集在缺血的心肌組織中，活化的PMN可釋放大量的毒性物質(zhì)，如H2O2、超氧陰離子及酶類物質(zhì)等，從而加劇了心肌缺血再灌注(MI/R)［1，2］。胰島素在臨床危重癥患者中應(yīng)用后能夠明顯降低其敗血癥和膿毒血癥的發(fā)生率［3］，研究［4］提示，胰島素可能存在重要的抗炎作用。結(jié)合我們2008年以來的研究工作［5］，近期我們又觀察了胰島素是否能夠通過抑制PMN在心肌組織中聚集而減輕局部及全身炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)MI/R心肌的作用。髓過氧化物酶(MPO)活性是反應(yīng)PMN聚集、浸潤程度的重要指標(biāo)，本研究通過檢測心肌組織中的MPO活性反應(yīng)PMN在局部心肌組織的浸潤情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 健康新西蘭大白兔(40只，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，雄性，體質(zhì)量2.5～3.0 kg。胰島素為諾和諾德公司產(chǎn)品;肌酸激酶同工酶(CK-MB)、MPO、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;伊文氏藍(lán)和氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma公司。

1.2 模型制備和實驗方案 用3%戊巴比妥鈉行兔耳緣靜脈注射麻醉(1 mL/kg)，心電圖監(jiān)測。切開實驗兔皮膚，沿胸骨左緣開胸，剪開心包，暴露心臟，以無創(chuàng)針帶單絲線在冠狀動脈(冠脈)左旋支(LCX)中部穿過，線兩端共套一聚乙烯管，形成閉合環(huán)，拉緊絲線，鉗夾聚乙烯管即阻斷LCX前向血流，心臟表面可見青紫，心電圖出現(xiàn)ST段上升，松開閉環(huán)后心肌獲得再灌注，青紫可減輕。出現(xiàn)以上情況認(rèn)為結(jié)扎成功。缺血15 min后進(jìn)行以下處理:將40只兔隨機(jī)分為4組，各10只。假手術(shù)組:絲線通過冠脈后不收緊聚乙烯管(即不形成缺血);GIK組:通過另一側(cè)耳緣靜脈輸注葡萄糖250 g/L+胰島素60 U/L+氯化鉀 60 mmol/L，4 mL/(kg·h);GK組:通過另一側(cè)耳緣靜脈輸注葡萄糖250 g/L+氯化鉀60 mmol/L，4 mL/(kg·h);對照組:通過另一側(cè)耳緣靜脈輸注0.9%NaCl，4 mL/(kg·h)。本實驗中，實驗兔行缺血45 min、再灌注6 h處理。

1.3 各組血漿CK-MB活力和hs-CRP測定 于再灌注6 h時取各組兔動脈血(2 mL)，靜置后4℃離心(2 500×g)10 min，采用分光光度法檢測血漿CK-MB、hs-CRP。具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 心肌梗死范圍測定 實驗兔再灌注6 h結(jié)束后，再次拉緊絲線，結(jié)扎LCX，并向左心室腔內(nèi)注入50 mL的2%伊文氏藍(lán)，立即取出心臟，－20℃凍存至心臟呈固體硬塊狀。垂直于心臟長軸將其切成約2 mm厚的薄片，單片置于含1%TTC(pH 7.4)2 mL的12孔培養(yǎng)皿中，37℃孵育15 min。用數(shù)碼相機(jī)拍照，圖像表現(xiàn)為伊文藍(lán)染色區(qū)(非缺血區(qū))、TTC染色區(qū)(紅染，缺血但仍存活組織)以及非TTC染色區(qū)(梗死心肌)，將圖像輸入計算機(jī)，用SigmaScan面積測算軟件進(jìn)行計算分析。心肌梗死范圍以每一心臟總梗死面積(INF)占總?cè)毖獏^(qū)面積(AAR)的百分比表示。

1.5 心肌組織中MPO活性測定 心臟組織稱重后，按質(zhì)量體積比1∶19加勻漿遞質(zhì)制成5%的勻漿液，隨后加入H2O2和顯色劑，水浴后立即在分光光度計460 nm處測定吸光度值(A值)。MPO活性以37℃反應(yīng)體系中H2O2被分解1 μmol為1個活力單位。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(ANOVA)，若總體差異顯著，再以SNK-q檢驗分析相應(yīng)兩組間的差異。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿CK-MB活性比較 GIK組、GK組、對照組、假手術(shù)組血漿CK-MB活性分別為(32.3± 2.8)、(120.2±11.4)、(89.5±11.1)、(123.5± 17.7)U/L;GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

2.2 各組心肌梗死面積比較 GIK組心肌梗死范圍為35.7%±2.7%、GK組為49.4%±2.6%、對照組為48.6%±3.2%、假手術(shù)組為9.2%±2.1%; GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

2.3 各組心肌組織MPO活性比較 GIK組、GK組、對照組、假手術(shù)組MPO活性分別為(0.64± 0.12)、(1.05±0.14)、(1.15±0.16)、(0.21± 0.06)U;與假手術(shù)組相比，對照組MPO活性升高近6倍，兩組相比，P＜0.01;GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

2.4 各組血漿hs-CRP水平比較 GIK組、GK組、對照組、假手術(shù)組hs-CRP分別為(6.98±0.91)、(10.23±1.24)、(10.98±1.08)、(2.07±0.48) mg/L;GIK組與對照組相比，P＜0.01;GK組與對照組相比，P＞0.05。

3 討論

研究［6］發(fā)現(xiàn)，胰島素不僅具有調(diào)節(jié)糖、脂肪等各種營養(yǎng)物質(zhì)代謝的作用，還具有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎和抗動脈粥樣硬化等效應(yīng)。關(guān)于胰島素在MI/R中的作用機(jī)制，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為胰島素通過代謝機(jī)制促進(jìn)心肌細(xì)胞對葡萄糖的攝取和更有效的利用，增加缺血心肌的能量供應(yīng)，間接發(fā)揮保護(hù)受損心肌的作用。研究［7］發(fā)現(xiàn)，胰島素主要通過磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶—內(nèi)皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)途徑來激活細(xì)胞內(nèi)的“生存信號”，從而減少心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。同時，臨床試驗顯示，在危重病患者中強(qiáng)化胰島素治療能夠明顯降低患者膿毒血癥和敗血癥的發(fā)生率［8］。Chaudhuri等［9］發(fā)現(xiàn)，對急性ST段抬高的心肌梗死患者，胰島素強(qiáng)化治療能夠同時降低血漿C-反應(yīng)蛋白和淀粉酶A的水平。

心肌組織發(fā)生缺氧、壞死后引起炎性反應(yīng)，釋放活性分子和化學(xué)因子，同時表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，促使PMN與心臟冠脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，并滲透血管內(nèi)皮在心臟受損組織中聚集，最終將釋放大量的活性氧自由基和分泌各種水解酶類，直接對心臟組織造成損害［2，3］。其中，PMN在心臟局部的黏附和浸潤是炎癥反應(yīng)的起始，亦是隨后發(fā)生炎性損傷的重要過程，對這一反應(yīng)的抑制將會減輕MI/R過程中的炎性損傷。鑒于MPO是PMN激活后釋放的一種主要酶類，其可以作為反映局部PMN活性的一個標(biāo)志。在本研究中，我們觀察到進(jìn)行胰島素干預(yù)治療后可降低MI/R兔心肌組織MPO活性，即減少PMN在受損心肌組織中的浸潤、積聚。通過抑制PMN積聚使CK-MB水平下降、心肌梗死面積減小，這可能是胰島素發(fā)揮心臟保護(hù)作用的途徑之一。

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