胡曉璐，王占科

(1中國人民解放軍第94醫(yī)院，南昌330006;2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

實(shí)驗(yàn)室診斷是醫(yī)學(xué)診斷的重要內(nèi)容。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的飛速發(fā)展，大量未知生物大分子不斷被發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室診斷面臨著巨大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著高分子微球技術(shù)和納米量子點(diǎn)技術(shù)逐步用于實(shí)驗(yàn)室診斷，極大地提高了診斷的靈敏度，某些極微量生物大分子可以簡便快速地被檢測出來。現(xiàn)將流式微球技術(shù)及納米量子點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用進(jìn)展情況綜述如下。

1 微球

微球是直徑為微米至納米的固體顆粒，是一種性能良好的載體，在生物分離與純化、細(xì)胞培養(yǎng)、臨床診斷、藥物緩釋控制等方面具有良好的應(yīng)用前景。微球可由多種材料構(gòu)成，如聚苯乙烯、聚多糖類、二氧化硅、聚丙烯酸脂、聚丙烯酰胺等。目前應(yīng)用最廣泛的是聚苯乙烯微球［1］。聚苯乙烯微球具有機(jī)械性能好、吸附能力強(qiáng)、表面反應(yīng)能力強(qiáng)、粒徑均一、單分散性能好、制備方法簡單、表面積大及表面弧度有利于抗原決定簇、抗體、核酸、菌體等結(jié)合位點(diǎn)的暴露而處于最佳的反應(yīng)狀態(tài)，從而提高實(shí)驗(yàn)室診斷的靈敏度，因此在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)中得到很好的應(yīng)用［2］。

免疫診斷微球是指微球偶聯(lián)特異性抗體、抗原或核酸片段的微球。偶聯(lián)抗體的微球可用于診斷相對應(yīng)的抗原，偶聯(lián)抗原的微球可診斷相對應(yīng)的抗體，偶聯(lián)核酸片段的微球可診斷互補(bǔ)核酸片段。免疫微球診斷試劑必須滿足三個(gè)要求:①微球在液體中分散性好;②微球參與的凝集反應(yīng)強(qiáng);③微球反應(yīng)特異性強(qiáng)。聚苯乙烯微球疏水性強(qiáng)，生物大分子的疏水部位非特異性吸附在微球表面，但這種非特異性物理性吸附的作用力不夠強(qiáng)，因此在不影響單分散性的前提下，須對聚苯乙烯微球表面進(jìn)行功能化修飾，使其表面帶有羧基、氨基等能與抗原、抗體、核酸片段進(jìn)行化學(xué)鍵偶聯(lián)的官能團(tuán)。功能化修飾可極大地增強(qiáng)結(jié)合牢固性，避免抗原、抗體、核酸片段的脫落和蛋白質(zhì)交換現(xiàn)象。在眾多功能化修飾官能團(tuán)中，表面羧基化的微球與生物分子反應(yīng)活性高，應(yīng)用領(lǐng)域最為廣泛。

2 流式微球技術(shù)(CBA)

CBA是將微球編碼技術(shù)、熒光染料標(biāo)記系統(tǒng)、流體學(xué)、激光技術(shù)、數(shù)據(jù)分析軟件等整合在一起產(chǎn)生的一項(xiàng)新技術(shù)，該技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速分析和分選的技術(shù)。FCM與微球診斷技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的CBA與傳統(tǒng)的FCM相比，其檢測的數(shù)據(jù)和分析是通過微球表面上所攜帶的熒光信號來完成。該技術(shù)巧妙地將編碼微球的特異性與FCM的高度靈敏性相結(jié)合，可同時(shí)測定液態(tài)體系中的多種可溶性蛋白、核酸及菌體成分，可同時(shí)獲得多重信息的分析平臺，具有所需樣本量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快、多通量同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)，其功能明顯優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)、核糖核酸酶保護(hù)分析(RPA)等目前實(shí)驗(yàn)室診斷常用的生物分析方法［3］。Horejsh等［4］以不同大小的微球作為載體，利用分子信標(biāo)技術(shù)及生物素—親和素之間的特異性結(jié)合特點(diǎn)，在流式細(xì)胞儀上實(shí)現(xiàn)了對三種呼吸病原體核酸的檢測。Summerbell等［5］用該技術(shù)對DNA上的堿基進(jìn)行了微編碼。李錦霞等［6］建立CBA檢測血小板特異性自身抗體的方法，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測血小板多種抗體可以提高檢測陽性率。王占科等［7］應(yīng)用CBA與ELISA技術(shù)對人血清胰島素進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)前者的可重復(fù)性、線性范圍、靈敏度優(yōu)于后者。

CBA在小分子物質(zhì)，尤其在多組分高通量同時(shí)檢測中優(yōu)勢顯著。筆者所在實(shí)驗(yàn)室正在研發(fā)利用CBA檢測小分子物質(zhì)體系，有望建立實(shí)驗(yàn)室診斷分析的技術(shù)平臺。

3 量子點(diǎn)(QDs)

生物體系既特殊又復(fù)雜，為了能同時(shí)測定更多的物質(zhì)，對生物熒光探針有很高的要求:應(yīng)當(dāng)具有較好的光穩(wěn)定性，不易被光解或發(fā)生光漂白;對生物體功能具有較小的影響;具有良好的激發(fā)和熒光效率;敏感性高;光譜特征突出等。目前，CBA一般都采用傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)，但傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)有較多缺陷:①激發(fā)光譜窄，發(fā)射光譜寬，具有較長的拖尾，容易造成譜峰之間的重疊。②易發(fā)生光漂白和光解現(xiàn)象，光解產(chǎn)物對生物分子具有殺傷作用，對活體細(xì)胞有一定的毒性作用。③生物分子與每種熒光染料偶聯(lián)都需要特定的偶聯(lián)方式，在高通量的生物分子的專一性的標(biāo)識中有很大的局限性。近來出現(xiàn)的QDs成為當(dāng)今國際上備受關(guān)注的嶄新的納米生物熒光探針，其克服了CBA的上述缺陷，具有很多傳統(tǒng)熒光物質(zhì)和稀土元素不可比擬的獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)。

QDs又稱半導(dǎo)體納米微晶體，其半徑≤激子波爾半徑［8，9］，粒徑為1～100 nm，多由Ⅱ～Ⅵ組和Ⅲ～Ⅴ組元素所組成，主要有CdY(Y為S、Se、Te)，還有一些復(fù)合結(jié)構(gòu)以及多層結(jié)構(gòu)［10］。QDs是近年發(fā)展起來的一種新型熒光探針，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米微晶體。與傳統(tǒng)熒光染料相比，QDs具有如下優(yōu)點(diǎn):①具有尺寸效應(yīng)，QDs的粒徑越小，其表面積越大，表面的原子就越多，表面束縛能就越大，吸收的能量也越大，吸收光譜藍(lán)移現(xiàn)象越顯著，即存在量子尺寸效應(yīng)。②具有較大的斯托克斯位移(激發(fā)光與反射光之間的能量差)，發(fā)射光譜狹窄且呈高斯對稱(通常半高全寬僅40 nm)，光譜之間較難重疊，可提高實(shí)驗(yàn)室診斷靈敏度、特異性。QDs具有較寬的激發(fā)波長［11］，對激發(fā)光源要求不高，可以用同一激發(fā)光源同時(shí)激發(fā)多種不同顏色的QDs。③具有較高的發(fā)光效率［12］。④具有良好的生物相容性，對機(jī)體危害小，細(xì)胞毒性低，而且與生物大分子的偶聯(lián)方式相對簡單易行，不像傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記物，需要特定的偶聯(lián)方式［13］。⑤發(fā)光性質(zhì)可以調(diào)控。相同組分的QDs材料，可以通過調(diào)節(jié)粒徑大小，獲得從藍(lán)光到近紅光幾乎所有可見波長的光。⑥光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性高，抗光漂白能力強(qiáng)，光褪色現(xiàn)象輕，可經(jīng)過反復(fù)多次激發(fā)，不易發(fā)生熒光淬滅［14］，對生理代謝及化學(xué)物質(zhì)降解均有很強(qiáng)的抵抗力。⑦具有靈活的表面化學(xué)、生物可塑性。

QDs經(jīng)過功能化修飾，再與抗體或核酸片段耦聯(lián)形成QDs熒光探針，可用于檢測血液抗原或具有表面抗原的病原體、組織、細(xì)胞和核酸片段?；赒Ds的熒光探針和診斷系統(tǒng)可廣泛用于實(shí)驗(yàn)室診斷，有學(xué)者［15，16］將QDs與單克隆抗體通過生物素—親和素系統(tǒng)形成生物素化單克隆抗體和親和素化的QDs，利用雙抗體夾心法對人血清標(biāo)本中的前列腺特異性抗原進(jìn)行檢測。還有學(xué)者［17，18］利用鏈霉親和素的QDs和生物素化的抗體作為探針對大腸埃希菌 O157∶H7進(jìn)行檢測，與異硫氰酸熒光素(FITC)相比，具有更高的靈敏度和更好的穩(wěn)定性。Hu等［19］用 CdSe的 QDs實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞癌胚抗原(CEA)的檢測。Yu等［20］用CdSe/ZnS的QDs偶聯(lián)鼠抗人甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體特異性識別AFP，QDs抗AFP抗體探針通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，激光照射獲取特異性分布的腫瘤部位。QDs熒光探針技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室診斷中正發(fā)揮越來越重要的作用。

4 QDs熒光探針CBA

高性能QDs技術(shù)與CBA結(jié)合形成的QDs熒光探針CBA，為抗原、抗體、核酸片段等生物分子的實(shí)驗(yàn)室檢測提供了新的方法。QDs熒光探針CBA是一種液態(tài)生物芯片技術(shù)，是一個(gè)高通量、高速率及多功能生物技術(shù)平臺，可廣泛用于免疫分析、受體和配體識別分析、酶學(xué)分析等研究，是實(shí)驗(yàn)室診斷以及生命科學(xué)研究中的一大熱點(diǎn)。該技術(shù)的核心是對微球進(jìn)行編碼和QDs熒光探針的制備。目前，對微球的編碼方式較多，有顏色編碼、阻抗編碼、粒徑尺寸編碼等。

微球熒光顏色編碼主要是用不同濃度的傳統(tǒng)熒光或不同粒徑不同濃度的QDs對微球進(jìn)行染色編碼，形成不同顏色、不同熒光強(qiáng)度的微球。其工作原理主要為不同熒光顏色的微球編碼不同的待測物質(zhì)，熒光微球表面攜帶熒光探針強(qiáng)度代表待測物質(zhì)的濃度。天津大學(xué)材料學(xué)院率先將QDs技術(shù)引入微球熒光顏色編碼的液態(tài)生物芯片中，制備出不同粒徑或不同濃度的QDs熒光顏色編碼的微球和QDs熒光探針，已經(jīng)用于腫瘤標(biāo)記物的檢測［21］。

阻抗編碼微球CBA主要是利用阻抗作為物質(zhì)的屬性，從超導(dǎo)體到絕緣體，阻抗作為連續(xù)變量，其阻抗信息理論上趨于無限多。微球阻抗的無限性決定著阻抗編碼微球CBA檢測通量的無限性，理論上可對微球進(jìn)行無限種的編碼。筆者所在實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的微球阻抗編碼技術(shù)于2007年獲得中國知識產(chǎn)權(quán)，其研究正在深入進(jìn)行中，已取得初步的成果［22］。

粒徑大小編碼即根據(jù)微球粒徑大小進(jìn)行編碼，也可實(shí)現(xiàn)多通量同時(shí)檢測分析的目的。此編碼要求微球粒徑均一性好。不同粒徑的微球編碼不同的待測物質(zhì)，通過流式分析，再對散點(diǎn)圖區(qū)域及直方圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即可確認(rèn)待測物質(zhì)的種類及待測物質(zhì)平均熒光強(qiáng)度值，平均熒光強(qiáng)度與待測物質(zhì)的濃度成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可換算出待測物質(zhì)的濃度。錢建瑞等［23］采用生物素化的羊抗兔IgG和QDs標(biāo)記的鏈霉親和素為熒光探針，建立了一種靈敏度高、選擇性好的檢測雌三醇的競爭免疫法。王楠等［24］采用羧基化的綠色QDs，通過羧基與禽流感單克隆抗體氨基共價(jià)結(jié)合，制備了測定禽流感病毒的QDs探針，并結(jié)合CBA，建立了QDs熒光探針CBA檢測禽流感病毒的新方法。

綜上所述，QDs與CBA快速發(fā)展，為實(shí)驗(yàn)室診斷提供了新的方法。QDs熒光探針CBA所需標(biāo)本量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快、方法簡便，可多通量同時(shí)分析，在實(shí)驗(yàn)室診斷中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前。

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