蔣而康

（安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036）

iPSCs臨床應(yīng)用安全性的研究進展

蔣而康

（安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036）

誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是被重新編程的、具有多能性的成體細胞。最近的研究證實，iPSCs能夠達到與胚胎干細胞同樣的全能性。源于成體的iPSCs對藥物或毒性篩選、醫(yī)療研究以及疾病專一性治療提供了極其有價值的細胞來源，然而，在應(yīng)用于臨床之前，必須克服潛在的風險，包括iPSCs誘導(dǎo)中病毒的整合、基因的改變。iPSCs潛在的風險涉及外源因子的轉(zhuǎn)入、目標細胞的改變及誘導(dǎo)因子的表達和重新激活等。本文回顧iPSCs的應(yīng)用前景和面臨的挑戰(zhàn)，同時對誘導(dǎo)安全性iPSCs的方法進行了討論。

誘導(dǎo)多能性干細胞；臨床應(yīng)用；安全性

在2006年，Yamanaka等首次通過表達4種外源轉(zhuǎn)錄因子，Oct4，Sox－2，Klf4和c－Myc將小鼠成纖維細胞重新編程逆轉(zhuǎn)成為多能性干細胞，并將該類干細胞稱為誘導(dǎo)多能性干細胞［1］。在此之后的5年，全世界的研究者對iPS領(lǐng)域的研究熱情高漲。繼從小鼠成體細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細胞后，研究者從人的成體細胞也成功誘導(dǎo)得到人的iPS細胞。iPS細胞與胚胎干細胞非常相似，能夠分化成內(nèi)、外、中胚層來源的任一種成體細胞，而且不涉及胚胎毀損等倫理學問題，同時個體特異來源的iPS細胞在移植時不會產(chǎn)生免疫排斥。利用iPS細胞通過四倍體囊胚注射方法獲得了存活并具有繁殖能力的小鼠，首次證明iPS細胞具有與胚胎干細胞相同的全能性［2］。因此，iPS細胞擁有無限的應(yīng)用潛力。

1 疾病專一性iPSCs用于醫(yī)學研究和疾病治療

iPSCs最大價值在于它的個體特異性，來自病人自身的體細胞被重編程為iPS細胞，繼而分化產(chǎn)生病人專一的細胞、組織和器官用于病人的移植治療。疾病專一性iPSCs（Disease－specific iPSCs）為在體外再現(xiàn)和研究病理過程提供了一個前所未有的機會。幾個研究組已經(jīng)成功獲得多種病人iPSCs，例如腺苷脫氨酶－重癥聯(lián)合免疫缺陷?。ˋDASCID）、III型高雪病（gaucher disease type III）、1型糖尿?。↗uvenile diabetes mellitus）、帕金森病（Parkinson disease）、亨廷頓?。℉untington disease）、唐氏綜合征（Down Syndrome）等疾病專一性iPS細胞［3］。以患者或疾病特異性的iPS細胞為對象的實驗性用藥，能篩選出針對個體或疾病有效的藥物，為藥物的篩選和疾病的治療提供了一種全新的探索模式。通過iPSCs模型，可以詳細研究疾病相關(guān)的表型起源。

顯而易見，iPSCs技術(shù)的長期目標在于細胞治療。研究者希望病人專一性的iPSCs能夠治愈或減輕某種功能減退的疾病的癥狀，同時無需免疫抑制藥物。來自病人的iPSCs在臨床應(yīng)用前，需要先矯正作為病因的遺傳改變。在人源化的小鼠模型采用iPSCs來治療鐮刀狀貧血癥。野生型的β球蛋白β－globin基因通過同源重組取代缺陷基因，移植基因矯正的iPSCs衍生的造血前細胞成功地緩解了患病動物貧血的癥狀。用攜帶野生型基因的慢病毒（lentivirus）轉(zhuǎn)染來自范可尼貧血癥（Fanconi anemia，F(xiàn)A）患者的成纖維細胞能夠產(chǎn)生iPSCs，并且能夠分化成表型正常的脊髓的以及血液中的造血前細胞［4］。但是，基因修飾、插入突變和非內(nèi)生基因的表達可能阻止iPSCs的臨床應(yīng)用。最近在iPSCs和h ESCs研究中，采用鋅指核酸酶通過同源重組可以高效率地矯正遺傳缺陷，同時無須使用病毒，這可能是一個矯正人的細胞中內(nèi)在的遺傳缺陷的理想方法。以上的研究為病人專一性iPSCs用于治療疾病奠定了基礎(chǔ)［4］。然而，在個體專一性iPS細胞應(yīng)用于臨床前還有許多障礙需要克服，其中之一是iPS細胞的安全性。

2 iPSCs安全性研究的新發(fā)現(xiàn)

iPSCs臨床應(yīng)用的誘人前景使得對其進行核型分析成為一個重要的研究課題。Yu.M.Minina等［5］通過染色體核型分析和熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)，在iPSCs細胞系觀察到X染色體單體，其模式染色體數(shù)為39。在研究的2個iPSCs細胞系中均呈現(xiàn)染色體不穩(wěn)定性，而且在其中的1個iPSCs細胞系我們檢測到染色體重排和染色體片段的存在。研究提示對iPSCs進行細胞遺傳學評估的重要性。Veronica Ramos－Mejia等［6］的研究表明，在誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs后，如果持續(xù)表達外源的誘導(dǎo)因子，可能導(dǎo)致細胞的基因組不穩(wěn)定性，如實驗產(chǎn)生的人iAND－4 iPSC細胞系為的非整倍體細胞系，其代表性核型是（47，XY，＋1，＋5，－17）。

由于成體細胞的起源，誘導(dǎo)的人iPSCs細胞應(yīng)有正常的二倍體基因組，而獲得性的染色體畸變尚未充分評估。Yoav Mayshar［7］等通過核型分析、比較基因組雜交（CGH）等方法研究了66個人的iPSCs（HiPSC）和38個人的胚胎干細胞（HESC）的基因組完整性。結(jié)果提示，有相當多的細胞系帶有全部或部分染色體畸變，其中一部分在染色體水平得到驗證。幾種畸變來自細胞培養(yǎng)，其它的可能來自作為iPSC來源的成體細胞。實驗也揭示早期的非整倍體HiPSCs細胞，提示在細胞重新編程中有相當大的選擇性壓力。分析表明，在HiPSCs細胞trisomy 12（chr12三體）有很高的發(fā)生率，導(dǎo)致細胞周期相關(guān)基因有更高的豐度。這種非整倍性可能限制HiPSCs細胞的分化潛力，并增加其致瘤性。

3 導(dǎo)致iPSCs遺傳不穩(wěn)定性的因素

3.1 iPSCs誘導(dǎo)方法產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定性

到目前為止，大部分iPSC細胞系是用反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體整合基因組［8］，導(dǎo)入重編程因子（e.g.OCT4，SOX2，KLF4，c－MYC）。雖然，在iPSC誘導(dǎo)完成后，反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入的基因處于表觀遺傳的沉默狀態(tài)，但是，這種方法產(chǎn)生的iPSC中的轉(zhuǎn)基因可能在病人體內(nèi)重新激活，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和惡化的嚴重風險，從而影響臨床應(yīng)用。同時，基因插入引起的突變也可能導(dǎo)致體內(nèi)移植時細胞轉(zhuǎn)化和惡化的風險。

3.2 細胞重編程因子影響iPSCs的遺傳不穩(wěn)定性

Oct－3／4，Sox－2，Klf－4和c－Myc四因子成功用于從人、鼠成體細胞產(chǎn)生iPS細胞［1］?？傮w上說，Oct－3／4和Sox－2是誘導(dǎo)干細胞的關(guān)鍵因子，而Klf－4和c－Myc有助于增加誘導(dǎo)效率。然而，這些重編程因子都是腫瘤相關(guān)性因子，在這些因子驅(qū)動下產(chǎn)生的iPS細胞可能存在安全隱患，具有致瘤性。從安全的角度看，從成體產(chǎn)生iPS細胞應(yīng)該采用最少量的，嚴格控制的，完全可逆的，充分了解的的誘導(dǎo)因子。

4 誘導(dǎo)產(chǎn)生安全iPSCs的方法進展

在體外誘導(dǎo)iPSCs產(chǎn)生自體移植的細胞用于疾病治療具有重要的臨床價值。然而，在iPSCs應(yīng)用于臨床前需要考慮一些關(guān)鍵的問題。一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是是找到新方法使得對基因組的修飾最小。

既然導(dǎo)致iPSCs產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定性的因素主要有2種，即基因插入引起的突變和誘導(dǎo)因子本身的致瘤作用，那么，產(chǎn)生安全iPSCs的策略就在于2個方面，（1）減少直至沒有基因整合的發(fā)生；（2）減少直至沒有細胞重編程基因的使用。

4.1 減少iPSCs的細胞重編程因子

不使用致癌因子如c－Myc和Klf4誘導(dǎo)iPSCs是一個重要的進展［8］。近來，在無Myc和Klf4條件下，采用其他的因子組合從小鼠和人成纖維細胞成功誘導(dǎo)出多能干細胞。然而，病毒導(dǎo)入的其他基因激活也同樣可能導(dǎo)致腫瘤。事實上，在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)其他誘導(dǎo)因子如Oct4，Sox2和Nanog的高水平的表達，同時外源表達Oct4能夠誘導(dǎo)上皮組織的增殖。減少誘導(dǎo)因子或病毒載體將顯著降低反轉(zhuǎn)錄病毒插入突變。幾個研究組已經(jīng)證明用單個病毒載體導(dǎo)入多個基因?qū)蚪M的影響程度最小。這種方法運用一種慢病毒載體，它可以從一個啟動子表達多順反子mRNA，其原理在于在誘導(dǎo)因子編碼序列之間加入2A自我切割的肽段或聯(lián)用內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）和2A肽段。令人吃驚的是，每個研究都證明單個病毒足夠?qū)⑴咛ズ统审w細胞誘導(dǎo)成多能干細胞，但是使用慢病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒帶來的轉(zhuǎn)基因激活和插入誘變?nèi)匀淮嬖?。而且，當iPSCs衍生細胞移植到病人體內(nèi)時，殘存的轉(zhuǎn)基因表達可能抑制iPSCs的分化潛力，并導(dǎo)致很高的致瘤風險。從根本上說，如果要產(chǎn)生安全的用于臨床的細胞，沒有病毒整合的iPSCs細胞是必須的。

4.2 通過病毒整合誘導(dǎo)iPSC，隨后切除整合的基因

通過基因組整合轉(zhuǎn)錄因子，隨后切除插入的基因，實現(xiàn)了這一目標。幾個研究組報道了通過質(zhì)粒和慢病毒攜帶4種因子整合進基因組誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs，隨后使用Cre－lox介導(dǎo)的剪切（Cre－lox mediated excision）從基因組中清除轉(zhuǎn)基因序列［9］。雖然這種方法的進展是顯著的，其局限在于不能清除殘存的載體序列，因此仍然具有插入誘變的風險。目前，研究者已經(jīng)繞過這一問題，使用piggy Bac轉(zhuǎn)座子（transposon）引入誘導(dǎo)因子。這個系統(tǒng)來自蛾（moth）的DNA轉(zhuǎn)座子，它在哺乳動物和小鼠中具有很高的活性。該轉(zhuǎn)座子已被用來導(dǎo)入基因、誘導(dǎo)突變，而且它不象其它的轉(zhuǎn)座子，在剪切后不留下任何的殘余序列。這樣，以單個載體表達系統(tǒng)和piggyBac轉(zhuǎn)座子從MEFs誘導(dǎo)iPSCs，再通過轉(zhuǎn)座子酶（transposase）清除載體和轉(zhuǎn)基因序列。重要的是，這些研究也證明體外產(chǎn)生多能干細胞無需持續(xù)表達外源誘導(dǎo)因子。

4.3 無病毒整合法產(chǎn)生iPSCs

最近一個產(chǎn)生iPSCs的策略是利用非整合病毒或質(zhì)粒導(dǎo)入誘導(dǎo)因子。Hochedlinger與合作者用腺病毒瞬時表達Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc因子，誘導(dǎo)鼠的成纖維細胞和肝細胞成為iPSCs，其過程中無病毒整合發(fā)生［10］。研究也顯示，以多個質(zhì)?；蛘弑磉_多順反子的單個質(zhì)粒為載體，通過誘導(dǎo)因子Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc能產(chǎn)生無病毒整合的小鼠iPSCs。近期，通過非整合的附加體質(zhì)粒成功產(chǎn)生完全無載體或轉(zhuǎn)基因序列整合發(fā)生的人iPSCs。雖然用這些技術(shù)成功產(chǎn)生無外源基因整合的iPSCs，但誘導(dǎo)效率很低，對于腺病毒介導(dǎo)的細胞重編程，需要幾輪轉(zhuǎn)染才能完成。因此，為了獲得無外源基因整合的iPSC細胞系，需要建立大量的侯選細胞株。而且，用這種方法產(chǎn)生的iPSCs需要進一步評估，以排除可能的病毒整合，因為有研究表明，即使用非整合的載體，仍有低頻率的整合發(fā)生。當然，這些研究還是將人的iPSCs向臨床應(yīng)用推進了一步。

4.4 基于蛋白重新編程產(chǎn)生iPSC

一些蛋白能夠被細胞攝取，這一現(xiàn)象導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)蛋白轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)域，即所謂的“轉(zhuǎn)化肽”或“細胞穿透肽”（transduction peptides or cell－penetrating peptides）。當與其它蛋白融合時，這些肽段能攜帶目的蛋白進入細胞，盡管效率有差異。因此，預(yù)期蛋白轉(zhuǎn)化是調(diào)控細胞命運的、無遺傳干預(yù)的另一條途徑。研究最廣泛的三個肽是果蠅的antennapedia peptide，單純胞疹病毒蛋白VP22（herpes simplex virus VP22）和HIV TAT protein transduction mo－tif［11］。另一方面，能夠?qū)⒌鞍讕нM細胞并轉(zhuǎn)化的非肽化合物可能取代穿膜肽。研究報道用細胞穿透肽（cell－penetrating peptide（CPP））融合轉(zhuǎn)化4因子，從小鼠和人的成纖維細胞產(chǎn)生穩(wěn)定的iPSCs。然而，以上2種方法產(chǎn)生iPSCs的效率都很低，需要進一步優(yōu)化。特別是單個因子的濃度必須測定以接近正常細胞內(nèi)生的水平。

4.5 化學因子法誘導(dǎo)多能干細胞

幾個研究組報道顯示聯(lián)用基因轉(zhuǎn)化和化學因子能誘導(dǎo)產(chǎn)生多能干細胞。這些特定的因子能取代致瘤的因子和增加誘導(dǎo)的效率。例如，kenpaullone，它能替代Klf4誘導(dǎo)小鼠的iPSCs?；瘜W因子如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（G9a histone methyltransferase）BIX－01294、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase）抑制劑5－aza－2′－deoxycytidine（5－azadC）和組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑valproic acid（VPA），顯著提高神經(jīng)干細胞和小鼠的成纖維細胞的誘導(dǎo)效率［12］。這些結(jié)果表明，高通量篩選能夠激活多能性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)或者抑制多能性的負調(diào)控的外源因子和小分子，最終可能找到完全以化學因子來誘導(dǎo)的iPSCs。與常規(guī)的誘導(dǎo)方法一致，這些化學因子在細胞內(nèi)作用的靶位與機制必須全面研究，然后才能應(yīng)用于臨床。

4.6 MicroRNAs誘導(dǎo)多能干細胞

MicroRNAs（miRNAs）是基因表達的重要調(diào)節(jié)子（regulators），miR－290 cluster的表達占鼠的ESCs中全部miRNA表達的70%，而miR21和let－7家族是胚胎成纖維細胞中最豐富的miRNAs。幾種miRNAs包括mir－21，mir－22和let7在干細胞的分化中起作用。這提示人為表達ESC專一性的microRNAs或抑制分化相關(guān)的microRNAs可能改變細胞的命運。與此一致，用miR－302（h ESC中miR－290的同功miRNA），轉(zhuǎn)化的癌細胞顯示上調(diào)許多關(guān)鍵的ESC標記物，包括Oct4，Sox2，and Nanog以及SSEA－3和SSEA－4。而且，這些細胞的基因組表現(xiàn)出與胚胎干細胞相似的高度的去甲基化狀態(tài)。miR－291－3p，miR－294和miR－295增加用Oct4，Sox2和Klf4將小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)為多能干細胞的效率［13］。這個研究也表明，miRNAs能夠替代c－Myc，甚至能形成更均一的iPSCs。這種方法的一個的難題在于難以控制導(dǎo)入細胞的miRNA數(shù)量。當然，采用miRNA，不管單獨使用，還是與無病毒的誘導(dǎo)方法共同作用，都能顯著提高iPSCs的安全性。

5 iPSCs安全性展望

在體外誘導(dǎo)iPSCs產(chǎn)生自體移植的細胞用于疾病治療具有重要的臨床價值。然而，在iPSCs應(yīng)用于臨床前需要考慮一些關(guān)鍵的問題。一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是是找到新方法使得對基因組的修飾最小。不需要胚胎產(chǎn)生的人iPSCs已經(jīng)開始應(yīng)用于體外疾病模型以及多能性機理的研究，它最有價值的用途在于細胞的替代治療，因為病人自身細胞重新編程產(chǎn)生的細胞不會產(chǎn)生免疫排斥。這些疾病包括帕金森，SCID，鐮刀狀貧血癥和退行性疾病等。如上所述，使用iPS細胞的安全性問題依然存在，解決這些問題是iPSCs臨床應(yīng)用的基本前提。許多產(chǎn)生iPSCs的方法都涉及基因插入誘導(dǎo)的突變。雖然在細胞重新編程后，轉(zhuǎn)入的基因表現(xiàn)為沉默，但這些原癌因子可能能重新激活而對組織有損害。對于成功重新編程得到的細胞，遺傳的或表觀遺傳的改變是否必不可少尚未可知，而且這些改變是否會帶到分化的細胞中，也是未知數(shù)。當然，隨著誘導(dǎo)iPSCs的技術(shù)發(fā)展，細胞重編程機理的進一步闡明，將有可能產(chǎn)生更安全的iPSCs，并最終應(yīng)用于臨床。

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Progress in Safe Induced Pluripotent Stem Cells for Clinical Applications

JIANG Er－kang
（SchooloftheLifeScience，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China）

Induced pluripotent stem cells（iPSCs）are somatic cells that have been reprogrammed to a pluripotent state.Recent researches confirmed that iPSCs can attain true pluripotency that is similar to that of ES cells.iPSCs from somatic cells provide an invaluable resources for drug or toxicology screening，medical research，and patient－specific cell therapy.However，there are currently a number of obstacles including virus integration and the genetic alteration of iPSCs that will need to be resolved before these cells may be considered safe for clinical applications.Potential risks are involved in the delivery of the endogenous factors，alterations in target cells，the cellular effects of the expression and reactivation of the factors that induce pluripotency.In this review，the potential and challenges of iPSC research are described，followed by a discussion of the safety concerns and how these concerns are currently being addressed.

Induced pluripotent stem cells（iPSCs）；clinical applications；safe

R4

A

1674－2273（2012）03－0091－04

2012－01－10

安徽農(nóng)業(yè)大學穩(wěn)定和引進人才科研資助項目。

蔣而康（1970－），男，安徽金寨人，博士，安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院教師，研究方向：細胞生物學。