王舒舒,龍子江,陳 明,劉金林,司文文,祝 浩
(安徽中醫(yī)學(xué)院藥理教研室,安徽合肥230038)
腦血管病是第一位的致殘?jiān)蚝偷诙坏闹滤涝颍?]。隨著現(xiàn)代科學(xué)及診療技術(shù)的進(jìn)步,人們對(duì)中風(fēng)病因病機(jī)的研究有了更進(jìn)一步的發(fā)展。本課題研究的開(kāi)竅醒腦顆粒,是一種中藥復(fù)方制劑,旨在通過(guò)觀察開(kāi)竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠的預(yù)防保護(hù)作用,考察其治療效果,探究其可能的作用機(jī)制,充分發(fā)揮中醫(yī)藥多途徑、多層次、多靶點(diǎn)的綜合治療效果的特點(diǎn),以期達(dá)到對(duì)腦卒中更好的防治效果[2]。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠120只,雌雄各半,體重240 g~260 g。由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,許可證:SCXK(蘇)2007-0004。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 受試藥物:開(kāi)竅醒腦顆粒(安徽中醫(yī)學(xué)院藥理教研室);陽(yáng)性藥物:華佗再造丸(廣州奇星藥業(yè)有限公司,批號(hào):9350);血栓誘導(dǎo)劑:凝血酶(SIGMA,批號(hào):T-4648);甲醛溶液(上海溶劑廠,批號(hào):98019);枸櫞酸鈉(上海星火制藥廠,批號(hào):50301);水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),批號(hào):T20060331);IL-1β ELISA 試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒、TNF-αELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司,批號(hào):XS201009241、XS201009654、XS201009498);其余普通試劑由安徽中醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 800型電動(dòng)離心機(jī):江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;電子太平:上海天平儀器廠;Anke TDL-5臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);精密電子天平:日本AND益R-12。
1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 取120只SD大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(華佗再造丸,0.72 g/kg)、開(kāi)竅醒腦顆粒低(1.08 g/kg)、中(2.16 g/kg)、高(4.32 g/kg)劑量組。各組大鼠按照上述劑量連續(xù)灌胃給藥7 d(1 mL/100 g體重),每天1次,假手術(shù)組及模型組給予等容量的生理鹽水。末次給藥后40 min,按照上述方法制備大鼠實(shí)驗(yàn)性腦卒中模型,次日繼續(xù)給藥[3]。
1.2.2 模型制備方法 大鼠禁食12 h,末次給藥后40 min,用3.4%水合氯醛以1 mL/100 g體重的劑量腹腔注射麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。頸正中部縱向切開(kāi)皮膚,切口長(zhǎng)約2 cm,游離出右側(cè)頸總動(dòng)脈,從頸總動(dòng)脈分叉處向上分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈,然后向顱底方向分離頸內(nèi)動(dòng)脈,在顱底處分離出翼腭動(dòng)脈,并結(jié)扎其根部,僅保留頸內(nèi)動(dòng)脈入顱底主干;結(jié)扎頸總動(dòng)脈,暫用2只微型動(dòng)脈夾間隔一定距離夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,在近心端頸總動(dòng)脈處用眼科剪剪一小口,插入導(dǎo)管(內(nèi)已抽好血栓誘導(dǎo)劑凝血酶10 μL加生理鹽水0.05 mL)固定后,移去近導(dǎo)管端血管夾,少量血液流入導(dǎo)管頭端,放置約10 min形成一小血栓;然后移去另一只血管夾,緩慢將此血栓和凝血酶注入頸內(nèi)動(dòng)脈后,拔出導(dǎo)管,并將頸總動(dòng)脈切口處結(jié)扎,縫合切口;術(shù)后單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組手術(shù)操作過(guò)程同上,只是不注入血栓和凝血酶,而注入等量生理鹽水。
1.2.3 組織取材及檢測(cè)指標(biāo) 術(shù)后24 h,用水合氯醛腹腔注射(3.4%,1 mL/100 g體重)麻醉,仰臥位固定,取各鼠腦組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
1.2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 每組隨機(jī)取10只動(dòng)物,處死并立即在冰盤(pán)內(nèi)開(kāi)顱取腦,將腦組織置于10%甲醛溶液固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,置于光鏡下,觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):(-)無(wú)病變 0 分;(+)輕度病變 1 分;(++)中度病變2分;(+++)重度病變3分。
1.2.5 腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量測(cè)定 取剩余10只大鼠新鮮的腦組織,稱重后放入盛有PBS的試管中,保存在-80℃冰箱備用。取保存在-80℃冰箱中腦組織塊,凍融后用冷生理鹽水沖洗,然后用濾紙吸干,放入玻璃勻漿器加入少量的生理鹽水(0.5 mL~1.0 mL),上下轉(zhuǎn)動(dòng)碾磨數(shù)十次使組織勻漿化。最后再加適量生理鹽水配成30 g/L腦組織勻漿,將勻漿以4000 r/min離心10 min,取上清液,采用ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α水平,按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。
結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。
表1 開(kāi)竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織病理變化的影響 (±s)
注:與假手術(shù)組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01
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圖1 開(kāi)竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)影響病理照片
由表1可見(jiàn),與假手術(shù)組比較,腦卒中模型組大鼠腦組織水腫、膠質(zhì)腫脹以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01),說(shuō)明模型組大鼠腦損傷嚴(yán)重;開(kāi)竅醒腦顆粒高、中、低劑量組與模型組比較,腦組織各種病變顯著緩解(P<0.05,P<0.01),能顯著降低中風(fēng)大鼠腦損傷程度,對(duì)大鼠血栓導(dǎo)致的中風(fēng)損傷有保護(hù)作用,并隨劑量增加作用增強(qiáng)。
鏡下病理觀察可見(jiàn):大鼠腦血栓形成后,鏡下觀察假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)元分布規(guī)則,數(shù)量正常,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不腫脹,腦組織除個(gè)別有輕度充血外其余均無(wú)充血水腫。模型組可見(jiàn)大小不等梗死灶形成,梗死灶形態(tài)不規(guī)則,梗死灶區(qū)神經(jīng)元大多數(shù)變性壞死或消失,膠質(zhì)細(xì)胞腫脹,體積增大,腦組織充血水腫,邊緣區(qū)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。陽(yáng)性藥物組及開(kāi)竅醒腦顆粒高、中、低劑量組少數(shù)仍有梗死灶發(fā)生,但面積較小,多數(shù)不發(fā)生梗死,神經(jīng)元分布及數(shù)量也基本正常,膠質(zhì)細(xì)胞腫脹也不明顯,腦組織充血水腫很輕,炎細(xì)胞浸潤(rùn)較不明顯。
結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 開(kāi)竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響 (±s,ng/L)
表2 開(kāi)竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響 (±s,ng/L)
注:與假手術(shù)組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01
組別 n I L-1 β T N F-α I L-6假手術(shù)組 60.3860±0.0687 0.3468±0.0269 0.6838±0.0651模型組 60.4702±0.0222 1) 0.4340±0.0265 2) 0.7820±0.0387 1)陽(yáng)性對(duì)照組 60.4083±0.0046 4) 0.3645±0.0332 4) 0.5113±0.0369高劑量組 60.4112±0.0089 4) 0.3657±0.1889 4) 0.4694±0.0497 4)中劑量組 60.4217±0.0116 4) 0.3788±0.0225 4) 0.4058±0.0144 3)低劑量組 60.4315±0.0069 4) 0.3962±0.0147 3) 0.3713±0.0531 4)
由表2可知,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-1β含量明顯增高,IL-6含量明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較,開(kāi)竅醒腦顆粒高、中、低劑量組腦組織中TNF-α和IL-1β含量明顯降低,IL-6含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
近幾年的研究發(fā)現(xiàn),腦卒中后血腫內(nèi)和血腫周?chē)嬖诿黠@的炎癥反應(yīng),并表達(dá)多種細(xì)胞因子,主要包括白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和核因子-κB(NF-κB)等[4]。這些細(xì)胞因子在腦卒中后腦損傷的病理過(guò)程中扮演著重要角色[5]。①TNF-α是體內(nèi)最主要的炎性介質(zhì)之一,是具有多效性作用的促炎性細(xì)胞因子[6]。腦卒中炎癥反應(yīng)的核心是TNF-α在血液中的激活。TNF-α在腦炎癥活動(dòng)中起著重要的作用,它能影響血管內(nèi)皮細(xì)胞活性并對(duì)血管炎性過(guò)程起到調(diào)節(jié)作用,可以促進(jìn)細(xì)胞黏附因子在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá),引起白細(xì)胞黏附、聚集并從毛細(xì)血管遷移至腦,從而對(duì)繼發(fā)性腦損傷起到關(guān)鍵的促發(fā)作用,導(dǎo)致腦血栓以及炎癥反應(yīng)的加重[7]。②IL-1β是炎癥細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化因子,是血漿和組織液中的主要分泌形式,也是腦組織中的主要形式,參與周?chē)庖叻磻?yīng)。IL-1β能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子活化B、T細(xì)胞,促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,誘導(dǎo)和促進(jìn)腦缺血后炎癥介質(zhì)對(duì)腦組織的損傷,損傷神經(jīng)元[8]。③IL-6被視為一種與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血相關(guān)的重要炎癥反應(yīng)分子。通常情況下,正常血漿中含有的IL-6量很少,只有在炎癥、感染和患有某些腫瘤等情況下,IL-6的含量會(huì)上升。IL-6與IL-6R形成復(fù)合物后,就可作用于表達(dá)模型gp130分子的細(xì)胞,引起生物學(xué)效應(yīng)[9]。IL-6可以抑制IL-1和TNF-α的合成,并能刺激產(chǎn)生它們各自的循環(huán)拮抗劑-可溶性腫瘤壞死因子-α受體(sTNF-αR)和白介素-1受體拮抗劑(IL-1RA),從而對(duì)抗IL-1和TNF-α所致的炎癥損傷。因此IL-6在腦缺血急性反應(yīng)期發(fā)揮了重要的抗炎作用。開(kāi)竅醒腦顆??缮逫L-6含量,保護(hù)腦組織,其作用機(jī)制有可能在于促進(jìn) IL-6 對(duì)抗 TNF-α、IL-1β 等其他炎癥因子[10]。
腦血栓形成后,血液中包含的大量炎癥因子流到腦組織,進(jìn)一步加重腦血栓后的損傷[11]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,開(kāi)竅醒腦顆粒對(duì)腦血栓引起的中風(fēng)形成的炎癥因子有抑制作用,通過(guò)降低炎癥因子的含量,進(jìn)而抑制級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生等機(jī)制來(lái)保護(hù)腦組織。這就進(jìn)一步驗(yàn)證近年來(lái)從炎癥角度出發(fā)對(duì)血栓性中風(fēng)疾病的研究是有現(xiàn)實(shí)意義的,同時(shí)為臨床中藥治療腦缺血病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
腦血栓是腦血管病中的急重癥,屬中醫(yī)學(xué)中風(fēng)、卒中范疇。自《黃帝內(nèi)經(jīng)》后,歷代醫(yī)家對(duì)其病機(jī)進(jìn)行了完善,多認(rèn)為陰虛血瘀、氣虛血滯是導(dǎo)致腦血栓的始動(dòng)因素。因此,破血逐瘀是腦血栓的基本治法。開(kāi)竅醒腦顆粒為中藥復(fù)方制劑,由水蛭、人參、郁金、石菖蒲、桂枝、人工牛黃等組成。方中水蛭破血、逐瘀、通經(jīng);人參大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫,補(bǔ)脾益肺;郁金活血止痛、行氣解郁、清心涼血、疏肝利膽。幾味藥合用共奏破血逐瘀、息風(fēng)開(kāi)竅之功?,F(xiàn)代藥理研究表明,水蛭具有抗凝、抗血栓、保護(hù)缺血再灌注損傷、降壓、降脂及改善血流變等作用;人參皂苷可加快脂質(zhì)代謝,行了正交優(yōu)化研究,采用L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。
表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
由表3的極差分析可知,3種因素的最佳組合為A2B3C2。從表3計(jì)算的K值可以知道,最佳水平組合為A3B3C3,因此用A3B3C3做驗(yàn)證性試驗(yàn),即浸提溫度90℃、料液比 1∶40、浸提時(shí)間 2.5 h,試驗(yàn)結(jié)果為聚合草提取液中黃酮類物質(zhì)含量是3.01%。所以最終確定最佳的提取工藝條件為A3B3C3。
通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),確定聚合草黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為:浸提溫度90℃、料液比1∶40、浸提時(shí)間2.5 h,在此提取工藝條件下聚合草提取液中黃酮類物質(zhì)含量為3.01%。且該方法設(shè)備簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,是一種較為理想的提取方法。不僅黃酮含量高,像蛋白質(zhì)和多糖等其他物質(zhì)含量也很高。在今后的開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中,我們可以嘗試對(duì)該草中的各種物質(zhì)進(jìn)行提取做一些保健和美容的產(chǎn)品。
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