張府君，程永杰，楊興鑫，李曉妮

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原030001）

金錢(qián)利膽丸是由丹參、金錢(qián)子、雞內(nèi)金、茵陳、虎杖、大黃、郁金、柴胡、延胡索等藥味組成的復(fù)方制劑，具有疏肝清熱，利膽排石的功效［1］。本品為醫(yī)院制劑，臨床主要用于治療膽囊結(jié)石、膽總管結(jié)石、肝內(nèi)膽管結(jié)石等。丹參為該制劑的臣藥，具有祛瘀鎮(zhèn)痛、活血通經(jīng)之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參還具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗凝血、消血栓、降低血液黏度、抗菌抗炎及提高機(jī)體免疫力等作用，其生理活性成分為丹酚酸B和丹參素等［2-3］。為了更有效地控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效，本文采用HPLC法測(cè)定金錢(qián)利膽丸中丹酚酸B（C36H30O16）的含量，以控制該制劑的質(zhì)量。該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性、準(zhǔn)確性均好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-2010A高效液相色譜儀；日本島津UV-2450型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純；丹酚酸B為對(duì)照品（含量測(cè)定用，編號(hào)：111562-200706，按98%計(jì)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：采用迪馬Kromasil BOD C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，流速1.0 mL/min，柱溫20℃，進(jìn)樣量20 μL；理論塔板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算不低于7000，此條件下丹酚酸B與其他組分能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，且陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾（見(jiàn)圖1）。

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備［4-5］精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品10.01 mg，置50 mL容量瓶中，加75%甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，加10.13 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（每 1 mL 中含丹酚酸 B10.01 μg）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5丸，剪碎，混勻，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，水浴中加熱回流60 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量除去丹參，制得陰性對(duì)照制劑，按2.2.1項(xiàng)下提取方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液和“2.2.3”項(xiàng)下的陰性樣品溶液與對(duì)照品溶液在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，由結(jié)果可知，供試品色譜呈現(xiàn)與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，且陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 金錢(qián)利膽丸高效液相色譜圖

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定，考察精密度。結(jié)果RSD=1.0%，小于3%。表明本方法精密度良好。

2.5 線性范圍考察

精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品適量，加75%甲醇制成 0.1268 mg/mL，分別精密進(jìn)樣 1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL、15.0 μL、20.0 μL。依法測(cè)定，丹酚酸 B進(jìn)樣量（μg）對(duì)峰面積作圖，進(jìn)行線性回歸，其回歸方程為 Y=1158.533286X+30653.8，r=0.9994。結(jié)果表明，丹酚酸B在0.1268 μg～2.536 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液，按上述色譜條件分別于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h 進(jìn)樣 5 μL，測(cè)得其平均峰面積值的RSD為1.4%，表明供試品溶液中的丹酚酸B在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批號(hào)的金錢(qián)利膽丸樣品6份，分別按供試溶液制備方法制成供試品溶液，測(cè)定其丹酚酸B的平均含量為022.3 mg/g，其RSD為0.92%，說(shuō)明此方法重現(xiàn)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收方法，精密稱(chēng)取已知含量的樣品適量，分別加入一定量的丹酚酸B對(duì)照品，照2.2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為96.5%，RSD為1.0%

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.9 樣品的含量測(cè)定

分別取4個(gè)批號(hào)的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照擬定的含量測(cè)定方法測(cè)定其丹酚酸B的含量，求得平均值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中丹酚酸B的含量測(cè)定 （n=3）

在平均含量的基礎(chǔ)上再下浮20%，故暫定其限度為0.15 mg/g。

3 討 論

考慮到丹酚酸B為酸性物質(zhì)，在中性流動(dòng)相中易發(fā)生離解，使含量偏低且拖尾嚴(yán)重，故在流動(dòng)相中加入少量甲酸，抑制其離解并改善峰形。本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-乙腈-甲酸-水（27∶8∶2∶63），甲醇-乙腈-甲酸-水（29∶9∶1.5∶60.5），甲醇-乙腈-甲酸-水（28∶9∶1.5∶62.5），甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）等流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）時(shí)，能顯著改善拖尾，丹酚酸 B 約穩(wěn)定在10.5 min出峰，色譜峰形較好，樣品中各峰均能達(dá)到很好的分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

試驗(yàn)中對(duì)供試品的提取方法和提取時(shí)間進(jìn)行了考察。分別采用超聲提取60 min與水浴回流提取60 min，樣品含量分別為 0.16 mg/g、0.23 mg/g，故選擇水浴回流提取60 min。對(duì)于提取時(shí)間，選擇了60 min、90 min、120 min，結(jié)果含量測(cè)定結(jié)果相同，所以采用回流提取60 min。

取丹酚酸B對(duì)照品溶液在190 nm～400 nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明丹酚酸B在286 nm處有最大吸收，所以選擇286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2005年版（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：52.

［2］劉艾林，李銘源，王一濤，等.丹參藥理學(xué)活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42（9）：641.

［3］田成旺，張鐵軍.HPLC法測(cè)定丹芩顆粒中黃芩苷和丹酚酸B的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28（10）：1738-1740.

［4］張化然.HPLC法測(cè)定天王補(bǔ)心丸中丹酚酸B的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2007，12（6）：19-21.

［5］胡丹，包利蘋(píng)，張兆靜，等.HPLC法測(cè)定寧坤養(yǎng)血丸中丹酚酸B的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，12（1）：37.