李 瓊，葉小利，陳 新，黃 靜，李學(xué)剛*,3

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；3.重慶市藥效學(xué)評(píng)價(jià)工程中心，重慶 400715)

天花粉為葫蘆科植物栝樓TrichosantheskirilowiiMaxim.或雙邊栝樓TrichosanthesrosthorniiHerms的干燥根，又名栝樓根，花粉、栝蔞粉，蔞粉等。其用藥最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》,主治熱病口渴、消渴(糖尿病)、黃疸、肺燥咳血、癰腫、痔痿[1]。現(xiàn)代藥理研究[2]發(fā)現(xiàn),天花粉具有致流產(chǎn)、抗早孕、抗癌、抗菌、抗病毒等作用。關(guān)于糖尿病的治療作用并不多，根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，天花粉提取物及復(fù)方對(duì)于改善糖尿病及其并發(fā)證的各種癥狀具有明顯效果[3-4]，而發(fā)揮降糖作用的有效部位及有效成分尚未見報(bào)道。本文采用人肝癌細(xì)胞HepG2和糖尿病小鼠模型,對(duì)天花粉醇提物和水提物降糖作用進(jìn)行研究，為進(jìn)一步的開發(fā)天花粉藥理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材和試劑 天花粉購于重慶市康源大藥房，經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院李學(xué)剛教授鑒定為葫蘆科植物栝樓的干燥根，鹽酸二甲雙胍片為湖北午時(shí)藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品(批準(zhǔn)文號(hào)H20052404)；RM1640培養(yǎng)基購自Gibico公司，HepG2細(xì)胞購自北京軍工所，胎牛血清購自Gibico公司，胰酶購自Sigma公司；葡萄糖試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20100819)，SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20100919)，MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)為20101201)，2,7-Dichloro-dihydrofluoresce-diacetateDCFH-DA購自Sigma公司；四氧嘧啶購自Sigma公司，化學(xué)試劑均為分析醇。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)KM雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(渝)20070001。飼養(yǎng)在室溫(23±2) ℃，相對(duì)濕度40%～60%條件下，自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)前穩(wěn)定3 d。

糖尿病小鼠模型：平衡喂養(yǎng)3 d，禁食不禁水，12 h 后，尾靜脈注射四氧嘧啶65 mg/kg，72 h后取血測(cè)定小鼠血糖，血糖值>11 mmol/L的小鼠為糖尿病模型小鼠。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀(BioTek)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，全自動(dòng)生化分析儀(EOS bravo Plus)，紫外分光光度計(jì)(UV1800)，真空冷凍干燥機(jī)(北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司)。

2 方法

2.1 天花粉提取物的制備 天花粉粉碎，準(zhǔn)確稱取4 000 g，用5倍量85%乙醇超聲提取2 h，過濾，提取3次，濾液合并濃縮得85%乙醇提取物。提取物用水混懸后，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物(組分Ⅰ)、乙酸乙酯提取物(組分Ⅱ)，正丁醇提取物(組分Ⅲ)。

準(zhǔn)確稱取天花粉1 000 g，加1 000 mL的PBS緩沖液(pH 7.2)于4 ℃冰箱中攪拌浸提24 h，用紗布過濾，濾渣棄掉，得濾液總體積1 050 mL，于4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min。棄去沉淀，收集上清液，凍干，得蛋白提取物(組分Ⅳ)。

2.2 天花粉提取物促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖吸收[5]HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%滅火的小牛血清的RM1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入100 mL培養(yǎng)瓶中，在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，傾去培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶消化，每3 d按1∶3比例傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

將HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清的RM1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入48孔板中,每孔加300 μL。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合后，把48孔板中的培養(yǎng)基更換無血清的培養(yǎng)基,每孔225 μL。將細(xì)胞分為空白組，二甲雙胍組，藥物組(組分Ⅰ，組分Ⅱ，組分Ⅲ，組分Ⅳ)，各給藥組根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分別在半數(shù)抑制濃度可能的濃度范圍附近設(shè)置3個(gè)給藥濃度，分別為100 mg/L、10 mg/L和1 mg/L，每個(gè)藥物每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)平行，每孔25 μL。PBS緩沖液為空白對(duì)照。培養(yǎng)24 h后，每孔取出115 μL培養(yǎng)液于全自動(dòng)生化分析儀的樣品杯中，待檢測(cè)。

促進(jìn)葡萄糖吸收率(%)=(原培養(yǎng)基中葡萄糖量-藥物組培養(yǎng)基中剩余葡萄糖量)×100%/(原培養(yǎng)基中葡萄糖量-空白對(duì)照培養(yǎng)基中葡萄糖量)

2.3 天花粉各組分對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響[5-6]取糖尿病小鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。組分Ⅰ(100 mg/kg)、組分Ⅱ(100 mg/kg)、組分Ⅲ(100 mg/kg)和組分Ⅳ(100 mg/kg)，高糖對(duì)照組灌胃蒸餾水，陽性對(duì)照組灌胃二甲雙胍片(100 mg/kg)。連續(xù)灌胃15 d，每日1次。第16天，禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血測(cè)定空腹血糖。

3 結(jié)果

3.1 天花粉提取物的制備結(jié)果 見表1。

表1 天花粉各組分的提取結(jié)果

天花粉用85%乙醇超聲提取后，所得總浸膏222 g。由表1可以看出，天花粉醇提物經(jīng)萃取后有一半的組分仍留在水相中，相比之下，正丁醇部位(組分Ⅲ)收率最高，其次是石油醚部位(組分Ⅰ)，最低的是乙酸乙酯部位(組分Ⅱ)；天花粉用PBS緩沖溶液提取所得的蛋白提取物收率為0.64%。

3.2 天花粉各組分對(duì)HepG2細(xì)胞消耗葡萄糖的影響 見表2。

表2 天花粉各組分對(duì)HepG2細(xì)胞消耗葡萄糖的影響±s，n=3) mmol/L

表2結(jié)果所示,天花粉水提Ⅳ組分具有明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞吸收葡萄糖的作用，在相同給藥劑量5 mg/L時(shí)，接近于二甲雙胍；在相同濃度下，組分Ⅳ促進(jìn)細(xì)胞消耗葡萄糖能力最強(qiáng)，石油醚、乙酸乙酯部位次之，正丁醇部位最弱。

3.3 天花粉各組分對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響 見表3。

表3 天花粉各組分對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響±s，n=10) mmol/L

表3結(jié)果所示，組分Ⅳ的降糖作用最強(qiáng)，結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似。故組分Ⅳ是天花粉的有效降糖部位。

4 討論

細(xì)胞降糖實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明，天花粉水提部位的降糖效果最好，石油醚、乙酸乙酯部位次之，正丁醇部位最弱。與有關(guān)文獻(xiàn)[5]報(bào)道類似。糖尿病日久,會(huì)出現(xiàn)陰損及陽，陰陽俱虛或久病入絡(luò)，血脈瘀滯，影響氣血的正常運(yùn)行，且陰虛內(nèi)熱，耗傷津液亦使血行不暢，而至血脈瘀滯，引發(fā)各種并發(fā)證[7-8]。隨著人們生活水平的提高，糖尿病人群不斷增加，天花粉具有確切的降糖作用。本實(shí)驗(yàn)利用肝癌細(xì)胞消耗葡萄糖模型和四氧嘧啶糖尿病小鼠模型結(jié)合提取分離手段，最終找出天花粉中降血糖的活性部位為天花粉凝集素蛋白部分。今后應(yīng)對(duì)該部位進(jìn)行成分研究，以促進(jìn)天花粉的開發(fā)利用。

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