王 艷，李遇伯，李 晶，周 鵬，畢月玲，陳學(xué)艷

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種起源于中胚層，具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞[1]。其在不同的誘導(dǎo)條件下,能分化成成骨細(xì)胞[2]、軟骨細(xì)胞[3]、脂肪細(xì)胞[4]等中胚層組織。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)各種原因(如衰老、骨質(zhì)疏松)引起的骨量減少往往是和骨髓中的脂肪組織增多伴行的，因此人們開始關(guān)注MSCs參與的成骨減少和成脂肪增多所引起的骨質(zhì)疏松[5]。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)卵巢切除法復(fù)制骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)大鼠模型，比較了正常和OP大鼠MSCs的形態(tài)學(xué)、生長曲線、骨向和脂向分化能力的差異，從MSCs角度闡釋OP后機(jī)體內(nèi)的病理學(xué)變化，為以MSCs為平臺(tái)，研究OP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡雌性Wistar大鼠(中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基(Gibeo)，胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、噻唑蘭(MTT)(上海生工)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、VitC、吲哚美辛、牛胰島素、異丁基黃嘌呤(Sigma)，巴比妥鈉、油紅O染料(北京索萊寶)，F(xiàn)icoll(GE Healthcare)。

1.3 誘導(dǎo)液配制

1.3.1 成脂誘導(dǎo)液 α-MEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、鏈霉素)+10 μmol/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L異丁基黃嘌呤(IBMX)+100 μmol/L吲哚美辛。

1.3.2 成骨誘導(dǎo)液 α-MEM+10 mL/dL胎牛血清(含100 U/mL青、鏈霉素)+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μmol/L維生素C。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，TS100型倒置相差顯微鏡(NiKon)，超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化)，TECAN infinite M200型酶標(biāo)儀(TECAN)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型與分組 12只6月齡Wistar雌性大鼠隨機(jī)分成模型組和假手術(shù)組，每組6只，模型組雙側(cè)卵巢切除法復(fù)制大鼠OP模型，假手術(shù)組大鼠找到卵巢后不切除。術(shù)后連續(xù)肌注青霉素3 d，5萬U/只。普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水，增齡3個(gè)月。

2.2 MSCs的分離與培養(yǎng) 大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，無菌條件下剝離脛、股骨，用完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，所得單細(xì)胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。原代MSCs培養(yǎng)7～10 d后傳代，之后培養(yǎng)3～5 d按1∶2比例傳代。

2.3 MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定 取P3代MSCs，經(jīng)0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后，制成單細(xì)胞懸液。以3×104Cells/mL接種于6孔板中。2 d后取出，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，山羊血清37 ℃孵育30 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，選用非相關(guān)IgG抗體作為陰性對照。PBS洗滌3次后，加入二抗37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，SABC反應(yīng)液37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，DAB顯色后立即于顯微鏡下觀察。蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

2.4 正常與OP大鼠MSCs生物學(xué)特性的比較

2.4.1 形態(tài)學(xué) 采用倒置相差顯微鏡，觀察并比較正常與OP大鼠MSCs的形態(tài)學(xué)差異。

2.4.2 MTT法檢測生長曲線 分別取正常與OP大鼠P3代MSCs，以2.0×103cells/mL接種到96孔板中，每孔終體積200 μL，從接種后的第1天起進(jìn)行MTT測定，每天測1板。均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組同時(shí)培養(yǎng)達(dá)4 h后，測定各孔吸光度值。測量波長為570 nm。

2.5 有及無誘導(dǎo)條件下正常與OP大鼠MSCs多向分化能力的比較

2.5.1 分組 正常組(正常大鼠MSCs未加誘導(dǎo)條件)，OP組(OP大鼠MSCs未加誘導(dǎo)條件),正常誘導(dǎo)組[正常大鼠MSCs+成骨(成脂)誘導(dǎo)液]，OP誘導(dǎo)組[OP大鼠MSCs+成骨(成脂)誘導(dǎo)液]。

2.5.2 骨向分化ALP染色比較 正常及OP大鼠P3代MSCs分別以1×105Cells/mL接種于預(yù)先置有無菌蓋玻片的6孔板中，按2.5.1分組，分別培養(yǎng)。14 d后取出相應(yīng)玻片進(jìn)行ALP染色，光鏡下觀察，比較。

2.5.3 脂向分化油紅O染色比較 正常及OP大鼠P3代MSCs分別以1×105Cells/mL接種于預(yù)先置有無菌蓋玻片的6孔板中，按2.5.1分組，分別培養(yǎng)。18 d后取出相應(yīng)玻片進(jìn)行油紅O染色，光鏡下觀察，比較。

3 結(jié)果

3.1 免疫組化染色檢測MSCs表面抗原 免疫組化染色鑒定結(jié)果顯示MSCs細(xì)胞呈CD29、CD44陽性，胞漿染色呈棕黃色(圖1、2)；CD34、CD45陰性(圖3、4)。

圖1 CD29

圖2 CD44

圖3 CD34

圖4 CD45

3.2 正常與OP大鼠MSCs形態(tài)學(xué)觀察 采用倒置相差顯微鏡觀察2組細(xì)胞的生長狀態(tài),經(jīng)傳代，正常大鼠MSCs還呈比較典型的集落方式生長，細(xì)胞為長梭形(圖5a)。而OP大鼠MSCs的增殖速度減慢，細(xì)胞形態(tài)寬大、扁平，可見少量脂肪細(xì)胞(圖5b)。

3.3 正常與OP大鼠MSCs生長曲線 從圖6可以看出，接種后所測得的生長曲線均呈S形。細(xì)胞接種后1～4 d OD值變化不大，到第4天OD值開始明顯增加，OD值于第7天達(dá)到頂點(diǎn)，隨后有減小的趨勢。對比正常組與OP組大鼠MSCs生長曲線，二者增殖趨勢基本相同，且符合細(xì)胞生長規(guī)律。但是在增殖能力上OP大鼠MSCs較正常組降低，經(jīng)配對樣本t檢驗(yàn)，t=3.316，df=8，P=0.011<0.05，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5a 正常大鼠P3代第5dMSCs(100×)

圖5b OP大鼠P3代第5dMSCs(100×)

圖6 正常與OP大鼠P3代MSCs生長曲線

3.4 骨向分化ALP染色比較 骨向誘導(dǎo)15d后運(yùn)用鈣鈷法進(jìn)行ALP染色，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)深棕色或深黑色顆粒狀或大片狀黑色沉淀，說明MSCs成功分化為OB。且正常誘導(dǎo)組ALP染色陽性細(xì)胞明顯多于OP誘導(dǎo)組。結(jié)果如圖7a、7b所示。

圖7a 正常誘導(dǎo)組MSCs ALP染色(100×)

圖7b OP誘導(dǎo)組MSCs ALP染色(100×)

3.5 脂向分化油紅O染色比較 脂肪誘導(dǎo)第4天，細(xì)胞胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)細(xì)黃色小脂滴，逐漸融合，倒置顯微鏡下可見的高折光性的小圓形脂滴，晶瑩透亮，主要集中于細(xì)胞核周圍。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞逐漸增多。繼續(xù)誘導(dǎo)，胞內(nèi)的小脂滴逐漸融合成大的脂滴，細(xì)胞體積逐漸增大，由原來的長梭形變?yōu)闄E圓形或多角形，細(xì)胞核被被大顆粒狀的脂滴擠于一側(cè)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，脂肪細(xì)胞的比例逐漸增高。油紅O染色顯示脂滴呈紅色，OP誘導(dǎo)組陽性數(shù)量明顯多于正常誘導(dǎo)組，結(jié)果如圖8a、8b所示。

圖8a 正常誘導(dǎo)組MSCs油紅O染色(200×)

圖8b OP誘導(dǎo)組MSCs油紅O染色(200×)

4 討論

MSCs可以表達(dá)多種標(biāo)記，但是缺乏特異性表面標(biāo)記，目前尚無具有高度特異性的MSCs表面標(biāo)記物，其鑒定的方法都是通過在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)分化表型，然后逆推得知是否為MSCs。因此本實(shí)驗(yàn)選取MSCs表達(dá)陽性的指標(biāo)CD29和CD44，以及表達(dá)陰性的指標(biāo)CD34和CD45作為鑒定參考指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道一致，證明分離培養(yǎng)擴(kuò)增的為大鼠MSCs[6]。

MSCs成骨分化的主要表現(xiàn)是細(xì)胞能夠合成、分泌表達(dá)成骨特異性的蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分,包括早期出現(xiàn)的ALP,Ⅰ型膠原等。ALP是成骨的標(biāo)志物之一，對它的測定可以反映細(xì)胞向成骨方向分化的程度。在基質(zhì)開始鈣化時(shí)成骨細(xì)胞的ALP活性最高，在鈣化接近結(jié)束時(shí),活性則最低，其活力在一定程度上反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。因此,ALP的活性可以代表成骨細(xì)胞的早期分化水平。其作用是水解有機(jī)磷酸鹽釋放出無機(jī)磷而作用于羥基磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它代表著骨形成的狀況，表明細(xì)胞分化的開始。

本研究結(jié)果表明，去卵巢對于大鼠MSCs形態(tài)及增殖能力均有一定的影響。正常大鼠MSCs呈典型的集落生長，細(xì)胞呈長梭形，傳代后增殖能力較強(qiáng)；而去卵巢后MSCs體積較大，細(xì)胞偏圓形，增殖能力大大下降。OP大鼠在分離完股骨和脛骨后，用PBS沖洗骨髓腔時(shí),沖出的液體可見大量的油脂浮于表面，可推測骨髓中脂肪含量較高。在相同條件誘導(dǎo)下，OP大鼠MSCs更傾向于向脂肪細(xì)胞分化，而正常細(xì)胞則更多向成骨細(xì)胞分化。 綜上所述，可初步推測去卵巢，增齡會(huì)導(dǎo)致骨髓腔內(nèi)脂肪組織增多，骨組織減少，從而造成骨質(zhì)疏松。

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