張雨潔 倪小英 應(yīng)雪萍

摘 要 以酶學(xué)分析的方法研究了兩種金屬離子單獨(dú)及聯(lián)合作用對青蛤蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活力的影響，兩種金屬離子單獨(dú)及聯(lián)合作用時的濃度分別設(shè)置為10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L，染毒時間為4天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青蛤3種消化酶活力大小為淀粉酶＞蛋白酶＞纖維素酶；在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的染毒濃度范圍內(nèi)，Zn2+、Cd2+單獨(dú)及聯(lián)合作用對青蛤的蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活力均產(chǎn)生顯著影響。其中，40mg/L的Zn2+對蛋白酶有顯著的激活作用，3種較高濃度的Zn2+及2種中間濃度的Zn2++Cd2+對纖維素酶表現(xiàn)出顯著的激活作用，其余的均對青蛤的這3種消化酶表現(xiàn)為抑制作用，且不同濃度的金屬離子對這3種消化酶的抑制作用表現(xiàn)出不同的變化趨勢。

關(guān)鍵詞 金屬離子 青蛤 蛋白酶 淀粉酶 纖維素酶

中圖分類號：Q5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

The Individual and Combined Effects of Zn2+and

Cd2+to the Activity of Clam Digestive Enzyme

ZHANG Yujie, NI Xiaoying, YING Xueping

(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325027)

Abstract Enzymatic method for the analysis of two metal ions separate and combined effects of clam protease, amylase and cellulase activity of the two separate and combined effects of metal ion concentrations were set at 10mg / L, 20mg / L, 40mg / L and 80mg / L, exposure for 4 days. The results show that clam three kinds of digestive enzymes amylase size> protease> cellulase; set exposure concentrations in the experimental range, Zn2+, Cd2+ separate and combined effects of clam protease, amylase and cellulose enzyme activity were a significant impact. Which, 40mg / L of Zn2+ significant protease activation, three kinds of high concentrations of Zn2+ and two kinds of intermediate concentrations of Zn2+ +Cd2+ cellulase showed significant activation, and the rest are for the three clam showed inhibition of digestive enzymes, and different concentrations of metal ions in these three kinds of inhibition of digestive enzymes showed a different trend.

Key words metal ions; clam; protease; amylase; cellulase

青蛤，是一種常見的底棲貝類，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，是我國南北沿海灘涂傳統(tǒng)養(yǎng)殖的主要貝類之一。自1990年室內(nèi)人工育苗獲得成功，有關(guān)青蛤人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)方面的研究比較活躍，而其生理生化方面的報道相對較少。本文以青蛤?yàn)檠芯繉ο?，探討兩種重金屬離子單獨(dú)及聯(lián)合作用對青蛤消化酶活力的影響，并分析了金屬離子對其消化酶的影響機(jī)制，以期為深入研究金屬離子消化生理和潔凈養(yǎng)殖生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，也為重金屬對青蛤毒理學(xué)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的青蛤成體取自溫州靈昆養(yǎng)殖場，選擇健康、大小較一致的個體作為實(shí)驗(yàn)對象，平均殼長3.41?.22cm，殼寬3.56?.25cm，殼高1.98?.18cm。實(shí)驗(yàn)前青蛤成體先在海水中暫養(yǎng)兩天。

1.2 染毒處理

實(shí)驗(yàn)用的藥品ZnCl2和CdCl2·2.5H2O均為分析純，實(shí)驗(yàn)濃度均以金屬離子濃度計算。根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Zn2+對青蛤的96hLC50為160mg/L）以及變量一致原則，Zn2+和Cd2+單獨(dú)及聯(lián)合作用中濃度梯度的設(shè)置為0、10、20、40、80mg/L。每個濃度35只青蛤，設(shè)三組平行組并設(shè)對照組（實(shí)驗(yàn)室配制養(yǎng)殖水，鹽度約30‰）。每隔24h更換相應(yīng)濃度的溶液，移除代謝產(chǎn)生的糞便。實(shí)驗(yàn)期間不投餌、不充氣。

1.3 酶活性測定

取染毒4天后的青蛤活體，將其置冰盤內(nèi)解剖，取出肝胰腺，剔除多余的組織塊，作為酶液制備的樣品。取大約1g濕重的上述樣品，加入10倍體積（w/v）預(yù)冷重蒸水，在冰浴中充分研磨勻漿10~15min，所得勻漿液再置于冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速10000r/min，溫度4℃）中離心30min，最后取上清液測定酶活，24h內(nèi)完成測定，酶活力的測定參照蔣傳葵等的測定方法，略有修改。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值北曜嘉蟊硎荊采用單因素方差（ANOVE，SPSS for Windows，版本11.5）分析對照組和實(shí)驗(yàn)各組間的差別。P＜0.05，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的Zn2+、Cd2+單獨(dú)及聯(lián)合作用對淀粉酶活力的影響

在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，金屬離子Zn2+、Cd2+單獨(dú)及聯(lián)合作用均顯著影響著淀粉酶的活力，且各處理組酶活力與對照組間均達(dá)到顯著性差異。在各處理組中，隨著試驗(yàn)設(shè)置濃度的增加，Zn2+對淀粉酶活力影響的變化趨勢表現(xiàn)為先升后降再升，在濃度為20mg/L時酶活達(dá)到最大。Cd2+對青蛤淀粉酶活力的影響規(guī)律與Zn2+類似，只是在20mg/L達(dá)到較大值后一直保持下降趨勢，在80mg/L時達(dá)到最小值，且各處理組酶活力之間達(dá)到顯著性差異。兩種金屬離子聯(lián)合作用時的變化趨勢與Cd2+一致，且80mg/L作用時酶活性與Cd2+40mg/L、80mg/L處理組的酶活性之間無明顯差異，但在10、20mg/L這兩個濃度之間Zn2++Cd2+作用的酶活力差異不如Cd2+顯著。

2.2 不同濃度的Zn2+、Cd2+單獨(dú)及聯(lián)合作用對蛋白酶活力的影響

青蛤蛋白酶對不同濃度不同金屬離子的敏感性不同，其總體變化趨勢也存在著一定的差異。在各處理組中，隨著試驗(yàn)設(shè)置濃度的增加，Zn2+作用時蛋白酶活力的變化趨勢表現(xiàn)為先降后升再降，在40mg/L時達(dá)到最大值，且顯著高于對照組，表現(xiàn)為促進(jìn)作用。Cd2+作用時則呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢，也在40mg/L時達(dá)到最大值，但與Zn2+40mg/L的酶活力存在著顯著差異，而與對照組相比，差異不顯著，抑制作用不明顯。兩種金屬離子聯(lián)合作用時對蛋白酶活力的影響一直保持下降的趨勢，10、20mg/L作用時酶活力之間差異不明顯，20、40mg/L作用下蛋白酶活力急劇下降，差異非常顯著，40、80mg/L作用時酶活性繼續(xù)顯著性下降。

2.3 不同濃度的Zn2+、Cd2+單獨(dú)及聯(lián)合作用對纖維素酶活力的影響

不同濃度的金屬離子對青蛤纖維素酶活力有著不同程度的不同影響。在試驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi)， 10mg/L的Zn2+抑制纖維素酶的活性，但高濃度則能激活酶的活力，且隨著濃度的升高對酶的激活作用顯著性下降。與對照組相比較，Cd2+顯著性抑制青蛤纖維素酶活性，但各處理組間均無顯著性差異，在數(shù)值上有先升后降再升的變化趨勢。兩種金屬離子聯(lián)合作用時對纖維素酶活力的影響規(guī)律與Zn2+一致，皆表現(xiàn)先升后降的變化趨勢，在20mg/L時達(dá)到最大值，且各處理組間及其與對照組間均達(dá)到到顯著性差異。只是兩種金屬離子聯(lián)合作用時在試驗(yàn)濃度設(shè)置的兩端對纖維素酶表現(xiàn)為明顯抑制作用，在其中間則表現(xiàn)為顯著的激活。

3 討論

3.1 金屬離子對消化酶活力的影響

金屬離子能以不同的方式與底物、酶的活性產(chǎn)物和酶本身產(chǎn)生極強(qiáng)的親和力，從而導(dǎo)致酶活性的改變，有些能對酶活性產(chǎn)生抑制作用，有些則激發(fā)酶的催化功能。本文研究發(fā)現(xiàn)，同種金屬離子，對同種生物的不同消化酶（如淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶）的作用存在較大的差異；不同種金屬離子對不同生物種類消化酶的影響不同，兩種金屬離子聯(lián)合作用時表現(xiàn)效果與兩者單獨(dú)作用并不一致，有時高于兩者的單獨(dú)作用，有時則低于兩者單獨(dú)作用，其聯(lián)合作用對消化酶活力的影響受到多方面因素的制約；不同濃度的金屬離子對同種生物的消化酶活性的影響亦不相同。

3.2 金屬離子對青蛤消化酶影響機(jī)制的探討

金屬離子以被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入生物體內(nèi)后，首先會引起機(jī)體內(nèi)酶和一些生物大分子的改變，進(jìn)而逐步在細(xì)胞、器官、個體、種群和生態(tài)系統(tǒng)各個水平上反映出來。然而，許多海洋生物會以解毒貯藏或積累金屬的方式來保證生命活動代謝。本實(shí)驗(yàn)研究表明，兩種金屬離子單獨(dú)及聯(lián)合作用時對青蛤3種消化酶活力的影響表現(xiàn)出不同的變化趨勢，這可能是由于金屬離子對不同消化酶的作用機(jī)制不同。

金屬離子在分子水平上的致毒機(jī)理主要有3種作用類型：（1）攝入的有害金屬阻礙生物大分子的重要功能；（2）有害金屬取代生物大分子中的必需金屬，使其喪失生物活性；（3）有害金屬改變生物大分子活性部位的構(gòu)象，從而改變其生物活性。Zn2+對青蛤的致毒效應(yīng)一般認(rèn)為是第3種。鋅作為一種重要的必需微量元素，當(dāng)其濃度超過生物的生態(tài)幅度時，多余的Zn2+就會與其它生物大分子（如酶、核酸等）相互作用，引發(fā)中毒。不同消化酶對不同濃度的Zn2+的應(yīng)答變化不同，則認(rèn)為與金屬硫蛋白（MT）的合成有關(guān)，金屬硫蛋白可以螯合和貯存多余的鋅，或與鋅形成Zn-MT結(jié)合物，來維持細(xì)胞內(nèi)Zn2+的濃度，以減輕其毒性。當(dāng)青蛤體內(nèi)累積的Zn2+濃度過高時，Zn2+與MT將達(dá)到飽和，而溢出到其他生物大分子如酶上，引起酶活性降低。Zn2+在一定濃度時分別對青蛤蛋白酶、纖維素酶表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。由此可說明某些金屬離子的高積累并不會對生物造成危害，而且這些金屬離子在一定濃度下甚至能夠通過酶的作用來提高貝類的攝食和消化吸收功能。

鎘作為生物體非必需元素，是一種有毒的重金屬，它不僅可以取代其它金屬離子（鋅、鈣、銅等）在蛋白中的位置，還可以與含—SH的大分子基團(tuán)（如酶、核酸等）緊密結(jié)合以產(chǎn)生致毒效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+顯著抑制了青蛤3種消化酶的活性。關(guān)于其對酶活性的抑制機(jī)制，作者推測與Zn2+相似。

各種水生生物生長受到多種重金屬聯(lián)合作用的綜合影響，重金屬間的相互作用大致有拮抗、協(xié)同、相加等類型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Zn2+和Cd2+聯(lián)合作用在低濃度時對青蛤的3種消化酶表現(xiàn)為拮抗，而在高濃度時對淀粉酶和蛋白酶具有協(xié)同抑制作用，對纖維素酶依舊表現(xiàn)為拮抗作用。鋅與鎘聯(lián)合作用對軟體動物消化酶的影響是相互制約、相互聯(lián)系的，至于其進(jìn)一步的機(jī)制還有待于深入探討。