摘要：采用ＣＴＡＢ法和改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取貴州從江香豬（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）新鮮肝臟的總ＲＮＡ，通過紫外分光光度法和凝膠電泳檢測ＲＮＡ質(zhì)量。結(jié)果表明，改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取的總ＲＮＡ的純度高，完整性好，優(yōu)于ＣＴＡＢ法。且改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取的豬肝臟總ＲＮＡ可用于ＲＴ－ＰＣＲ等后續(xù)分子生物學(xué)操作。

關(guān)鍵詞：ＲＮＡ提??；豬（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）；肝臟；ＣＴＡＢ法；Ｔｒｉｚｏｌ法

中圖分類號：Ｑ５９３＋．１；Ｑ５２２文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）03－0621-02

Ｆａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｐｉｇ Ｌｉｖｅｒ

ＹＵ Ｘｉａｏ－ｄａｎ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＴＡＢ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｌｉｖｅｒ ｏｆ Ｃｏｎｇｊｉａｎｇ Ｘｉａｎｇ－ｐｉｇ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ） ｉｎ Ｇｕｉｚｈｏｕ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｔｈａｎ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｔ ｗａｓ ａｌｓｏ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｕｃｈ ａｓ ＲＴ－ＰＣＲ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｐｉｇ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）； ｌｉｖｅｒ； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ

分離出純凈完整的ＲＮＡ是進(jìn)行基因表達(dá)分析及ＲＮＡ功能研究的基礎(chǔ)，在ＲＮＡ實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長ＲＮＡ［１］。目前提取動物組織總ＲＮＡ的方法很多，應(yīng)用較多的有苯酚法、ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ－酚抽提法等，由于ＲＮＡ極不穩(wěn)定，易被降解，ＲＮＡ酶無處不在，獲得高純度且完整的ＲＮＡ并不容易。尤其對于代謝旺盛的組織，如肝臟、心臟等的總ＲＮＡ的提取，一些方法尚有不盡如人意之處，如試劑盒法提取的成本高，ＲＮＡ產(chǎn)量較低，不利于后續(xù)分子生物學(xué)分析等。因此，ＲＮＡ的提取方法需要不斷摸索和改進(jìn)［２－４］。本實驗以貴州從江香豬（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）新鮮肝臟組織為材料，采用ＣＴＡＢ法和改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取總ＲＮＡ，以為后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)操作奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料與試劑

取現(xiàn)宰新鮮從江香豬肝臟，－８０ ℃保存?zhèn)溆?。實驗儀器包括研缽、低溫高速離心機、水浴鍋、紫外分光光度計等。所用試劑有ＭＯＰＳ、０．１％ ＤＥＰＣ水、Ｔｒｉｚｏｌ、ＣＴＡＢ提取緩沖液、水飽和酚、液氮等。

１．２實驗方法

１．２．１Ｔｒｉｚｏｌ法①取香豬新鮮肝臟組織０．１ ｇ置于研缽中，加入液氮快速研磨，然后加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ試劑，溶化后加至２．０ ｍＬ離心管中。②加入０．５ ｍＬ體積比為１∶１的氯仿－水飽和酚，上下顛倒混勻，靜置幾分鐘，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ。③吸取上層水相至另一離心管中，加入０．５ ｍＬ預(yù)冷的異丙醇混勻，室溫放置１０ ｍｉｎ，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清。④加入１ ｍＬ 體積分?jǐn)?shù)７５％的乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，重復(fù)２次，４ ℃、７ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄上清，超凈工作臺吹干，溶于３０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水，－８０ ℃儲存。

１．２．２ＣＴＡＢ法在李菁芳等［４］和左欣欣等［５］報道的ＣＴＡＢ法的基礎(chǔ)上進(jìn)行，步驟如下：①在２ ｍＬ的離心管加入０．５ ｍＬ ＣＴＡＢ提取緩沖液、１０ μＬ β－巰基乙醇于６５ ℃預(yù)熱。②取０．１ ｇ豬肝臟，加入液氮迅速研磨成粉末，將粉末狀樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的裝有ＣＴＡＢ提取緩沖液的離心管中，混合均勻。③６５ ℃水浴加熱１０ ｍｉｎ，期間每隔２ ｍｉｎ輕輕地?fù)u勻。④向混合物中加入１００ μＬ ２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．０）和０．５ ｍＬ水飽和酚輕輕混勻，再加入１００ μＬ體積比為２４∶１的氯仿－異戊醇混勻，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。⑤小心移取上清液到一個新的２ ｍＬ的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇混勻，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清液。⑥加入１ ｍＬ ７５％的乙醇漂洗，７ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心洗滌５ ｍｉｎ，棄乙醇，倒立離心管于超凈工作臺上使沉淀干燥，加入３０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水，－８０ ℃儲存。

１．２．３總ＲＮＡ純度和完整性檢測?。?μＬ制備的ＲＮＡ樣品用ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水稀釋到２００ μＬ，用７５２型紫外分光光度計分別測定樣品在２６０、２８０ ｎｍ波長下的吸光度，判斷其純度。用１．２％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測所提ＲＮＡ的完整性。

１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ鏈后，選用豬持家基因β－ａｃｔｉｎ的特異性引物對其進(jìn)行檢測，引物序列為：正向引物５′－ＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴ

ＣＡＣＣＡＣＣＡＣ－３′，反向引物５′－ＴＡＣ ＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣ

ＴＧＡＴＣ－３′。ＰＣＲ反應(yīng)體系為２５ μＬ：反轉(zhuǎn)錄ｃＤＮＡ模板１ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５ μＬ，引物各１ μＬ（１０ μｍ／Ｌ），Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １６ μＬ。ＰＣＲ擴增在ＰＴＣ－２００型擴增儀（Ｂｉｏ－ＲＡＤ）上完成，反應(yīng)程序為：９４ ℃，５ ｍｉｎ；９４ ℃，３０ ｓ，５７ ℃，４５ ｓ，７２ ℃，１ ｍｉｎ，３０個循環(huán)；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，于４ ℃下保存。產(chǎn)物進(jìn)行１．２％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

２結(jié)果與分析

２．１總ＲＮＡ純度和完整性

采用改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取的ＲＮＡ樣品稀釋后，經(jīng)紫外分光光度檢測，ＯＤ２６０ ｎｍ / ＯＤ２８０ ｎｍ均在１．８５～２．２０之間，表明所提取的ＲＮＡ樣品中所含的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，純度較高。ＣＴＡＢ法提取的樣本ＯＤ２６０ ｎｍ / ＯＤ２８０ ｎｍ在１．８左右，純度稍低。

用１．２％的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測所提取的總ＲＮＡ的質(zhì)量，結(jié)果如圖１所示，改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取的總ＲＮＡ純度高、完整性較好、２８ Ｓ和１８ Ｓ ｒＲＮＡ電泳條帶清晰，基本無拖帶現(xiàn)象，且２８ Ｓ ｒＲＮＡ的亮度約是１８ Ｓ ｒＲＮＡ的２倍，說明提取的ＲＮＡ完整性好，無蛋白質(zhì)等污染，為后續(xù)的分子生物學(xué)分析奠定了良好的基礎(chǔ)。ＣＴＡＢ法提取得到的樣品條帶較模糊，拖尾較嚴(yán)重。

２．２ＲＴ－ＰＣＲ檢測結(jié)果

對采用改良的Ｔｒｉｚｏｌ法所提取的豬肝臟組織總ＲＮＡ進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ檢測，由圖２可以看出，目的條帶清晰、位置正確（約５００ ｂｐ），說明改良Ｔｒｉｚｏｌ法所提?。遥危恋馁|(zhì)量和完整性都較高，可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)實驗的要求。綜合分析凝膠電泳和ＲＴ－ＰＣＲ檢測結(jié)果可知，改良Ｔｒｉｚｏｌ法適用于豬肝臟組織總ＲＮＡ的提取。

３討論

臟器代謝旺盛，相對于其他組織而言，一方面其基因表達(dá)豐度和蛋白含量較高；另一方面各種酶，包括核糖核酸酶的活性也高。因此有效地抑制核糖核酸酶活性和去除蛋白質(zhì)的污染是獲得高質(zhì)量臟器ＲＮＡ的關(guān)鍵［６］。本實驗使用液氮迅速處理新鮮的豬肝臟組織，以抑制內(nèi)源ＲＮＡ酶的活力；同時，還用ＤＥＰＣ溶液對實驗所用物品進(jìn)行了處理，使用ＲＮＡ專用儀器設(shè)備，操作過程中使用一次性ＰＥ手套和口罩等，以避免外源ＲＮＡ酶的污染，從而保證了總ＲＮＡ的完整性。

本研究采用Ｔｒｉｚｏｌ和ＣＴＡＢ法從貴州從江香豬肝臟提取總ＲＮＡ，兩種方法都能獲得總ＲＮＡ，但總ＲＮＡ的質(zhì)量有明顯差異。比較而言，ＣＴＡＢ法藥品配制繁瑣，實驗的操作時間長且提取效果不很理想。Ｔｒｉｚｏｌ提取試劑由酚與異硫氰酸胍組成，所需試劑較簡單，提取過程快速，總ＲＮＡ質(zhì)量也較高，適用于后續(xù)分子生物學(xué)操作。

參考文獻(xiàn)：

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［３］ 馬倩，張永宏，秦瑩，等． 松遼黑豬臟器總ＲＮＡ提取方法的改進(jìn)及應(yīng)用［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（１２）：５３８４－５３８５．

［４］ 李菁芳，黃劭毅，田仁鵬，等． 一種適用于ＲＴ—ＰＣＲ的杉樹類植物中總ＲＮＡ提取的方法［Ｊ］． 武漢植物學(xué)研究，２００４，２２（６）：５５１－５５６．

［５］ 左欣欣，陳澤宇，馬騰，等． 從動物組織中提取總ＲＮＡ的ＣＴＡＢ法［Ｊ］． 中國西部科技，２０１１，１０（２）：３５－３６．

［６］ 付月君，張志云，柴寶峰，等． 從棉鈴蟲體中提取總ＲＮＡ的一種有效方法［Ｊ］． 生物技術(shù)通報，２００４（５）：４０－４２．

（責(zé)任編輯向闈）

收稿時間：２０１１－０８－１１

基金項目：遵義師范學(xué)院生物學(xué)重點學(xué)科支持項目；遵義師范學(xué)院遵義區(qū)域經(jīng)濟研究中心項目（ＺＥ２０１０１１）

作者簡介：喻曉丹（１９６２－），女，副教授，主要從事動物解剖、動物生理研究工作，（電話）１３５９５２４７６４０（電子信箱）ｙｕｘｉａｏｄａｎｓｈｅｎｇｗｕｘｉ＠１６３．ｃｏｍ。