劉萍　鄭慧玲　吳建偉　蘇曉慶

摘要：以潮霉素抗性基因ｈｐｈ為篩選標記，以雙元載體ｐＰＫ２為基本骨架，將增強型綠色熒光蛋白基因ｅｇｆｐ置于組成型啟動子ＰｇｐｄＡ和色氨酸Ｃ終止子ＴｔｒｐＣ之間，構(gòu)建了組成性表達ｅｇｆｐ的載體ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ，利用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)入貴陽腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）表達。對轉(zhuǎn)化子進行ＲＴ－ＰＣＲ和熒光顯微鏡檢測，結(jié)果表明，ｅｇｆｐ基因在貴陽腐霉轉(zhuǎn)化子中能穩(wěn)定表達。

關(guān)鍵詞：貴陽腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）；基因轉(zhuǎn)化；綠色熒光蛋白；根癌農(nóng)桿菌

中圖分類號：Ｑ７８６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5801-03

貴陽腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）是貴陽醫(yī)學院蘇曉慶教授于１９９４年分離得到的一株滅蚊真菌［１］。經(jīng)研究證實它具有滅蚊能力較強、繁殖速度快、易于人工培養(yǎng)［２］和可移植性強以及對非靶生物相對安全等諸多優(yōu)點［３，４］。由于昆蟲病原真菌廣泛存在于自然界，真菌制劑一旦釋放到自然環(huán)境中，需要準確鑒別染病昆蟲是否為人工釋放的菌株制劑所致，而在真菌制劑中引入安全、可靠的遺傳標記則為其提供了可能。增強型綠色熒光蛋白（Ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其熒光比野生型強３５倍，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高效表達、無種系依賴性等特點，通過與目標基因融合，可進行真菌的細胞基因表達和蛋白定位檢測及細胞示蹤標記、突變體致病力檢測、生態(tài)學行為以及與其他生物互作等研究，因此是目前標記研究真菌的重要手段之一。此次研究以貴陽腐霉菌絲體為受體材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將含ｅｇｆｐ的表達載體轉(zhuǎn)入貴陽腐霉，以獲得帶有ＥＧＦＰ標記的貴陽腐霉菌株，為研究其對蚊幼蟲的入侵過程以及兩者之間的互作模式打下基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．３ 引物 試驗所用引物序列見表１。

１．２ 方法

１．２．１ ｅｇｆｐ組成性表達載體ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ酶切質(zhì)粒ｐＳＫ－ｈｐｈ，回收ＴｔｒｐＣ片段（７７０ｂｐ），與用相同酶切的質(zhì)粒ｐＵＣ１８連接轉(zhuǎn)化，重組載體命名為ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ。以質(zhì)粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１為模板，pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２為引物，ＰＣＲ擴增ｅｇｆｐ基因片段，用ＢａｍＨⅠ和 ＢｇｌⅡ雙酶切后純化回收，與同樣雙酶切的ｐＵＣ1８－ＴｔｒｐＣ連接，轉(zhuǎn)化驗證，命名為ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ。以質(zhì)粒ｐＡＮ７－１為模板，用引物ＰｇｐｄＡ１和ＰｇｐｄＡ２ＰＣＲ擴增ＰｇｐｄＡ基因片段，用ＫｐｎⅠ和ＢａｍＨⅠ雙酶切后純化，回收該目的片段，與經(jīng)過相同雙酶切的載體ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ連接，命名為ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ－ＰｇｐｄＡ，提取其質(zhì)粒，用ＨｉｎｄⅢ酶切后電泳，凝膠回收３．６ｋｂ的大片段ＰｇｐｄＡ－ＥＧＦＰ－ＴｔｒｐＣ，與相同酶切的質(zhì)粒ｐＰＫ２連接，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用ＢａｍＨⅠ單酶切驗證，得到正向連接的轉(zhuǎn)化子為質(zhì)粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ。

１．２．２ ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的根癌農(nóng)桿菌ＬＢＡ４４０４轉(zhuǎn)化 采用凍融法［５］。

１．２．３ 根癌農(nóng)桿菌介導的ｅｇｆｐ基因在貴陽腐霉的遺傳轉(zhuǎn)化 按龍朝欽等［６］的方法稍改動。取含質(zhì)粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的ＬＢＡ４４０４過夜培養(yǎng)物，用含２００μｍｏl／ＬＡＳ的ＹＥＰ液體培養(yǎng)基于２８℃振蕩培養(yǎng)６ｈ后，與貴陽腐霉菌絲混合，于２６℃培養(yǎng)１ｄ。棄上清，加入５００μＬＩＭ液體培養(yǎng)基（含２００μｍｏl／ＬＡＳ），于２６℃培養(yǎng)２ｄ。懸浮沉淀，將該混合物涂布到ＫＰＹＧ２平板上（含２００ｍｇ／Ｌ潮霉素Ｂ和２００ｍｇ／Ｌ頭孢霉素），于２６℃培養(yǎng)直至抗性菌絲長出。

１．２．４ 轉(zhuǎn)化子的ＲＴ－ＰＣＲ檢測 貴陽腐霉及轉(zhuǎn)化子總ＲＮＡ的提取采用ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取。用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）逆轉(zhuǎn)錄并去除基因組ＤＮＡ。以pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２為引物，利用ＰＣＲ對得到的抗性菌落進行分子驗證，擴增ｅｇｆｐ基因片段。

１．２．６ 熒光的觀察 臨時制片，利用Ｏｌｙｍｐｕｓ熒光顯微鏡在波長４８０ｎｍ下進行熒光觀察、照相。

２ 結(jié)果與分析

２．１ ｅｇｆｐ組成性表達載體ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的構(gòu)建與酶切驗證結(jié)果

２．２ 組成性表達ｅｇｆｐ重組菌株的篩選與驗證

２．３ 貴陽腐霉轉(zhuǎn)化株ｅｇｆｐ的熒光檢測

３ 討論

綠色熒光蛋白（ＥＧＦＰ）來源于海洋生物水母Ａｅｑｕｏｒｅａvｉｃｔｏｒｉａ，其作為報告基因已被廣泛地應用于絲狀真菌生物學研究中。２００９年，ＤｅＳｉｌｖａ等［７］將帶ＥＧＦＰ標記的植物病原真菌Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ接種４種植物宿主，通過對熒光的直接定量研究它對不同植物的損害情況。２００８年，Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ等［８］將帶有ＥＧＦＰ標記的曲霉菌接種到棉花種子中，利用ＥＧＦＰ標記監(jiān)測真菌的生長、侵染途徑、定殖以及黃曲霉毒素的產(chǎn)生。另外，Ｈｕ等［９］利用含有ＥＧＦＰ的金龜子綠僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）基因重組菌株，研究在植物根際不同深度土壤中，昆蟲、植物和真菌三者之間的相互作用。金凱等［１０］將組成性表達ｅｇｆｐ的球孢白僵菌轉(zhuǎn)化株接種菜青蟲，利用冰凍切片和熒光顯微觀察技術(shù)可清楚地檢測到病原菌在昆蟲體表附著、菌絲穿透體壁以及菌絲從寄主體內(nèi)長出等侵染過程。牛秋紅等［１１］也構(gòu)建了含ｅｇｆｐ的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化粉紅粘帚霉，為研究真菌侵染機理的模型打下了試驗基礎(chǔ)。

貴陽腐霉是一種重要的昆蟲病原真菌，開發(fā)其真菌制劑用于蚊蟲的生物防治很有價值。ＲＴ－ＰＣＲ和熒光顯微檢測顯示，ｅｇｆｐ基因在貴陽腐霉中已穩(wěn)定表達，生物測定試驗也表明，具有較強熒光的轉(zhuǎn)化子的毒力與野生菌株相比沒有明顯改變。這一新的活體報告基因?qū)⒃谫F陽腐霉的侵染過程研究、基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導及發(fā)育生物學和細胞生物學等多個領(lǐng)域中有更廣泛的應用。

參考文獻：

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［２］ＨＵＡＮＧＳＷ，ＳＵＸＱ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎＰｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ，ａｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｍｏｓｑｕｉｔｏｌａｒｖａｅ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ，２００７，２６（３）：３８０－３８８．

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［１１］牛秋紅，柯 濤，張 林，等．適用于粉紅粘帚霉綠色熒光標記的重組質(zhì)粒的構(gòu)建及應用［Ｊ］．微生物學報，２０１１，５１（７）：９９１－９９７．