顧秋艷

[摘要]目的：研究基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和Ki-67在翼狀胬肉組織中的表達及臨床意義。方法：應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)方法（S-P法）對39例原發(fā)性翼狀胬肉及12例正常球結(jié)膜組織中的MMP-2及Ki-67蛋白進行檢測。結(jié)果：MMP-2及Ki-67蛋白在翼狀胬肉組織中的表達均高于正常結(jié)膜組，差異有顯著性意義（Z=-3.044，Z=-2.707，P均<0.05）。結(jié)論：MMP-2及Ki-67在翼狀胬肉中的表達明顯高于正常球結(jié)膜，提示翼狀胬肉組織中基底膜分解代謝和細(xì)胞增殖調(diào)控等方面發(fā)生異常了變化，在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。

[關(guān)鍵詞]翼狀胬肉；MMP-2；Ki-67；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號]R777.33 [文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1971-03

翼狀胬肉是臨床常見眼表病之一，發(fā)病普遍認(rèn)為與紫外線照射、氣候干燥、接觸粉塵油煙等有關(guān)。表現(xiàn)為呈三角形增厚的球結(jié)膜組織病變，頭部侵襲生長至角膜，導(dǎo)致病人視功能下降，但其確切的發(fā)病機制至今仍不甚明了[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）是MMps家族成員之一，對細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）有廣泛的降解作用。MMP-2在翼狀胬肉中參與ECM的破壞及新生血管的形成而備受關(guān)注。Ki-67是存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)的抗原，其增殖指數(shù)可以敏感地反映出細(xì)胞的增殖活性。翼狀胬肉組織存在異常增殖調(diào)控，使胬肉上皮及間質(zhì)細(xì)胞和正常結(jié)膜處于不同細(xì)胞分裂周期。我們運用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測39例翼狀胬肉，12例正常球結(jié)膜標(biāo)本中MMP-2和Ki-67的表達，探討其在翼狀胬肉組織中的表達情況，從分子水平進一步探討翼狀胬肉發(fā)病機制，為胬肉的化學(xué)藥物治療和靶向治療提供一定的思路。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本來源：收集原發(fā)性翼狀胬肉組織標(biāo)本39例，來自于2009年3月～2009年7月在河北省眼病治療中心進行翼狀胬肉切除術(shù)的患者。其中男性21例，女性18例；平均年齡60.5歲；靜止期12例，進展期27例。病程6個月～30年不等；生長部位：鼻側(cè)38例，顳側(cè)1例；對照組取正常球結(jié)膜12例，取材部位為鼻側(cè)瞼裂部近角鞏膜緣球結(jié)膜組織。其中男性7例，女性5例；平均年齡41.2歲。所有病例術(shù)前均排除其他角膜及結(jié)膜疾病，近3個月無眼部用藥史及手術(shù)史。

1.2 實驗試劑：鼠抗人MMP-2單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司（產(chǎn)品編號sc-13595）；鼠抗人Ki-67單克隆抗體濃縮液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），產(chǎn)品編號ZM-0166；S-P免疫組化試劑盒、濃縮型顯色劑二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法：免疫組織化學(xué)染色（S-P法）：標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定24h后進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。5μm連續(xù)切片后，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水；于濕盒內(nèi)用3%H2O2溶液室溫孵育20min去除內(nèi)源性過氧化氫酶；枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原熱修復(fù)；正常山羊血清封閉；分別滴加由0.01M PBS稀釋的MMP-2及Ki-67的一抗，工作濃度均為1：50；切片放入濕盒中，4℃冰箱過夜；分別滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液， 37℃溫箱孵育30min；DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，自來水充分沖洗中止顯色。蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片。以0.01M 磷酸鹽緩沖液（PBS）液替代一抗做陰性對照，將已知陽性切片作為陽性對照。

1.4結(jié)果判定MMP-2的表達情況根據(jù)染色強度及染色陽性細(xì)胞的百分率來計分。陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分；在10%～25%為1分；在26%～50%為2分；>51%為3分；染色強度計分標(biāo)準(zhǔn)：無色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；黃褐色計3分。分值計算：將兩種計分結(jié)果相乘并分為以下等級：0分：為陰性（-）；1～2分：為弱陽性（+）；3～4分：為陽性（++）；5分～：為強陽性（+++）。Ki-67定位于細(xì)胞核，陽性反應(yīng)為細(xì)胞核呈棕褐色、顆粒狀。Ki-67蛋白評分標(biāo)準(zhǔn)：在400倍視野下計數(shù)500個細(xì)胞，陽性細(xì)胞<5%為陰性（-），5%～25%為弱陽性（+），26%～50%為陽性（++），>50%為強陽性（+++）。>25%即為Ki-67高表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進行秩和檢驗和Spearman等級相關(guān)分析。以a=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1 MMP-2蛋白的表達正常球結(jié)膜組織中未見MMP-2表達（圖1），翼狀胬肉組織中MMP-2呈陽性表達，陽性物質(zhì)位于近基底部的上皮層細(xì)胞的胞漿中，呈彌漫性或散在分布的棕黃色或棕褐色顆粒狀（圖2），差異有顯著性意義（P<0.05） （表1）。39例翼狀胬肉標(biāo)本中，靜止期MMP-2陽性表達率為50%（6/12），進展期陽性表達率為51.8%（14/27），靜止期和進展期MMP-2陽性表達率比較無顯著性差異（P>0.05）。不同性別和不同年齡組MMP-2陽性表達亦無顯著性差異（P>0.05）（表1）。

2.2 Ki-67蛋白的表達：正常球結(jié)膜組織中僅有少量上皮層的基底細(xì)胞表達Ki-67，陽性率為25%（3/12）（圖3）。翼狀胬肉Ki-67的陽性表達主要分布在上皮組織，以上皮的基底細(xì)胞為明顯，染色呈細(xì)胞核型，為棕黃色到棕褐色顆粒，基質(zhì)層亦有少量表達（圖4）。Ki-67在翼狀胬肉中的陽性表達高于正常結(jié)膜組織，差異有顯著性意義（P<0.05）。39例翼狀胬肉標(biāo)本中，靜止期Ki-67陽性表達率為（33.3%） （4/12），進展期陽性表達率為77.8%（21/27），進展期Ki-67蛋白表達明顯高于靜止期，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異（P<0.05）。不同性別和不同年齡組Ki-67陽性表達亦無顯著性差異（P>0.05）（表1）。

2.3 翼狀胬肉MMP-2與Ki-67表達相關(guān)性分析：胬肉中MMP-2和Ki-67的表達進行Spearman等級相關(guān)分析，二者表達不具相關(guān)性（r=0.037，P>0.05）（表2）。

3討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）是一類依賴金屬鋅離子的蛋白水解酶家族。通過多種機制如：水解細(xì)胞外基質(zhì)、組織重建、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等參與多種生理、病理過程[2]。MMP-2又稱明膠酶，其底物是IV型膠原。Girolamo[3]首次報道MMP在翼狀胬肉和培養(yǎng)的胬肉上皮細(xì)胞中的表達，參與了胬肉生長過程的炎癥、組織基質(zhì)重塑和血管的發(fā)生。Dushku等[4]發(fā)現(xiàn)多種MMP在胬肉組織中表達，檢測到MMP 2、3、7、9、14、15的過度表達。

本次研究實驗顯示， 39例翼狀胬肉組織陽性表達率為51.2（20/39），正常球結(jié)膜上皮未見MMP-2陽性表達，與Di等[5]研究結(jié)果相同。Zeng等[6]用明膠酶譜分析得出的結(jié)果與我們的組化結(jié)果一致。袁靜等[7]用培養(yǎng)的結(jié)膜及翼狀胬肉上皮細(xì)胞檢測MMP-2表達，發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉上皮細(xì)胞MMP-2在蛋白及基因水平的表達較結(jié)膜上皮細(xì)胞明顯增加。Yang[8]等研究亦表明在培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中MMP-2表達高于正常結(jié)膜組織和細(xì)胞。翼狀胬肉上皮細(xì)胞異常分泌MMP-2，導(dǎo)致前彈力層溶解，突破了 Bowman氏膜屏障，使胬肉細(xì)胞向角膜及深層浸潤[6]。

Ki-67抗原是由Gerdes[9]于1983年在增殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種核抗原，也是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志基因。Ki-67的表達出現(xiàn)于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達高峰，分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇，到G0期則不表達，半衰期為1h或更短。它是一個反映細(xì)胞增殖率的可靠指標(biāo)，因為幾乎所有組織中都有Ki-67表達。其高表達是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記。多種腫瘤組織都有Ki-67高表達[10]，Ki-67對腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷也具有重要意義。

本次研究實驗顯示，Ki-67在翼狀胬肉近基底膜的上皮細(xì)胞層呈陽性表達。39例翼狀胬肉組織中的陽性表達率為64.1%（25/39），明顯高于正常球結(jié)膜組織，與他人研究結(jié)果一致[11]。說明翼狀胬肉組織存在異常的增殖調(diào)控，胬肉的上皮及間質(zhì)細(xì)胞和正常結(jié)膜處于不同的細(xì)胞分裂周期，導(dǎo)致組織過度增殖。進展期胬肉Ki-67陽性表達（77.8%）明顯高于靜止期胬肉（33.3%），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異（P<0.05），說明進展期翼狀胬肉細(xì)胞的增殖活躍，翼狀胬肉組織中存在增殖調(diào)控異常。

通過對MMP-2和Ki-67在胬肉中的表達進行Spearman等級相關(guān)分析，二者表達不具相關(guān)性（r=0.037，P>0.05）。提示這兩種蛋白是通過破壞細(xì)胞ECM和異常增殖等不同作用機制促使球結(jié)膜組織發(fā)生改變，導(dǎo)致翼狀胬肉的發(fā)生。

綜上所述，MMP-2及Ki-67在翼狀胬肉中的表達明顯高于正常球結(jié)膜，說明翼狀胬肉組織中基底膜分解代謝和細(xì)胞增殖調(diào)控等方面發(fā)生異常了變化，在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

[參考文獻]

[1]朱雅琴，姚克.翼狀胬肉發(fā)病機制研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)：眼科學(xué)分冊，2005，29（3）：163- 165.

[2]Malemud CJ. Matrixmetalloproteinases （MMPs） in health and disease：an overview[ J]. Front B iosci，2006， 11：1696-1701.

[3] Di Girolamo N，McCluskey P， Lloyd A，et al.Experssion of MMPs and TIMPs in human pterygia and cultured pterygium epithelial cells.[J] Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（3）：671-679.

[4]Dushku N， John MK， Sohultz GS， et al.Pterygia pathogenes is corneal invasion by matrix meta lloproteinase expression altered lmibal epithe lialhasal cells[J].Arch Ophthalmol， 2001，119（5）：695-706.

[5]Di GN，Wakefield D， Coroneo MT. Differential Expression of Matrix Metalloproteinase and Their Tissue Inhibitors at the Advancing Pterygium Head [J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（13）：4142-4149.

[6]Jun Zeng， Jiang DY， Liu XP， et al. Expression of MatrixMetalloproteinase in Human Pterygia[J]. Eye Science， 2004，20（4）：22-24.

[7]袁靜，胡燕華，王適群.翼狀胬肉上皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅱ的表達[J].眼科研究，2004，22（5）：511.

[8]Yang SF， Lin CY， Yang PY， et al.Increased expression of gelatinase （MMP-2 and MMP-9） in pterygia and pterygium fibroblasts with disease progression and activation of protein kinase C[J].Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009，50（10）：4588-4596.

[9]Gerdes J， Lemke H， Baisch H，et al.Cell cycle analysis of a cellproliferation associated human nuclear antigen defined by the mono clonal antibody Ki67[J].J lmmunol，1984，l33（4）：l710-1715.

[10]Liu M， Lawson G，Delos M，et a1.Predictive vale of the fraction of cancer cells immunolabeled for proliferating cell nuclear antigen or Ki67 in biopsies of head and neck carcinomas to identify lymph node metastasis，comparison with clinical and radiologic examinations[J].Head Neck，2003，25（4）：280-288.

[11]李海燕，劉克蘭，袁志剛，等.翼狀胬肉中Ki-67和VEGF的表達[J].中國實用眼科雜志，2006，24（9）：946-948.

[收稿日期]2012-06-19[修回日期]2012-08-25

編輯/張惠娟