谷廷敏等

[摘要]目的：觀測臨床創(chuàng)面愈合中表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）基因和表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFr）基因的表達，探討EGF和EGFr基因表達變化在創(chuàng)面修復中的作用。方法：應用原位雜交方法對臨床患者斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合中EGF、EGFr基因表達變化進行了動態(tài)觀察，并進行半定量分析。結果：臨床創(chuàng)面愈合過程中，EGF、EGFr基因表達有明顯規(guī)律性的變化，傷后4天，創(chuàng)面內(nèi)EGF基因表達較弱，EGFr基因表達很強；傷后10天，創(chuàng)面內(nèi)EGF基因表達明顯增強，分布范圍增大，而EGFr基因表達較傷后4天減弱，分布范圍減小；傷后16天，創(chuàng)面內(nèi)EGF、EGFr基因表達強度均較傷后10d明顯減弱，EGF表達強度接近傷后4天的水平，而EGFr基因表達已基本呈陰性。結論：EGF、EGFr基因表達變化與創(chuàng)面修復的過程有明顯相關，EGF、EGFr基因表達變化參與了創(chuàng)面修復過程，合理調(diào)控其表達變化有助于創(chuàng)面修復。

[關鍵詞]EGF基因；EGFr基因；創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]R622R318 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1985-02

創(chuàng)面愈合是一個復雜的病理過程，涉及局部出血、滲出、炎性浸潤、細胞增殖分化和細胞外基質(zhì)沉積等過程。既往，筆者觀察到：在動物供皮區(qū)創(chuàng)面和燒傷患者創(chuàng)面中，EGF、EGFr基因有明顯的表達變化，提示：創(chuàng)面愈合中EGF、EGFr基因有明顯的規(guī)律性表達變化，且與創(chuàng)面愈合過程明顯相關[1-3]。為進一步探討EGF、EGFr基因表達變化與創(chuàng)傷愈合關系的普遍性，筆者又對臨床供皮區(qū)創(chuàng)面愈合過程中的EGF、EGFr基因表達變化進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1標本留?。哼x取燒傷或整形患者的中厚斷層供皮區(qū)創(chuàng)面共32例，男19例，女13例，年齡22～49歲?；颊邿o特殊疾患。供皮區(qū)創(chuàng)面位于大腿或下腹部。征得患者同意，分別于術后4天、10天、16天，在局麻下用眼科角膜環(huán)鉆切取包括創(chuàng)面、創(chuàng)基及少量皮下脂肪在內(nèi)的標本，并取正常皮膚作為對照。

1.2 原位組織雜交方法：將留取的標本置于4%的多聚甲醛液固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5μm的組織切片，用地高辛標記EGF、EGFr cDNA探針后，進行組織切片的原位雜交：組織切片脫蠟入水，0.2mol/L鹽酸酸化，蛋白酶K消化，酒精脫水，置預雜交液（42℃）預雜交4h，入雜交液雜交（42℃）17h后，用Dig-DNA labelling and detection（ Boegringer Mannheim公司產(chǎn)品 ）試劑盒觀察切片中EGF、EGFr基因活化表達的mRNA的變化情況，以確定創(chuàng)面愈合中EGF、EGFr基因表達狀況。400倍光鏡下測定其相對含量，以所見視野內(nèi)無陽性細胞為陰性，連續(xù)記數(shù)5個視野，求出每個視野內(nèi)陽性細胞數(shù)，當視野內(nèi)有10個以下陽性細胞時，表達強度確定為弱陽性（+）；當視野內(nèi)有11～20個陽性細胞時，表達強度確定為中等陽性（++）；當視野內(nèi)有21個以上陽性細胞時，表達強度確定為強陽性（+++）。統(tǒng)計學處理應用組間方差分析

2結果

本組中厚斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合時間平均為18.5天（17.5～19.5天）。所用地高辛標記的EGF、EGFr基因cDNA探針進行的原位雜交陽性結果為藍紫色細顆粒，分布于細胞漿或少量的胞核內(nèi)。正常皮膚內(nèi)無明顯的陽性細胞。傷后4天，EGFr基因在創(chuàng)面內(nèi)有明顯的表達，主要分布在創(chuàng)面內(nèi)的成纖維細胞胞漿和創(chuàng)緣上皮基底細胞胞漿內(nèi)，以及血管內(nèi)皮細胞和皮膚附屬上皮細胞中，多較密集分布，表達強度為（++--+++），視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)量為18.60±2.6；而EGF基因表達相對較弱，主要分布在創(chuàng)面淺層，陽性細胞呈稀疏分布，表達強度為（+），視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)量為9.50±1.6。傷后10天， EGF基因在創(chuàng)面內(nèi)表達較傷后4天增強，除分布在創(chuàng)面淺層的成纖維細胞胞漿和創(chuàng)緣上皮基底細胞胞漿內(nèi)以外，尚可見分布在血管內(nèi)皮細胞和皮膚附屬上皮細胞中，創(chuàng)面的中層和深層也可見有表達，多較密集分布，表達強度為（+++），視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)量為23.40±3.1；而EGFr基因表達較傷后4天減弱，分布范圍減小，主要分布在創(chuàng)面淺層，表達強度為（+--++），視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)量為11.50±1.3。傷后16天，EGF、EGFr基因在創(chuàng)面內(nèi)表達的強度較傷后10天均減弱。EGF表達強度接近傷后4天的水平，僅限于在臨近愈合上皮的淺層和創(chuàng)面的淺層，分布在成纖維細胞胞漿，表達強度近（+）左右，視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)量為10.45±1.2；傷后16天，EGFr基因表達已基本陰性，視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)量為2.3±0.6。

統(tǒng)計學分析，傷后10天EGF基因表達較傷后4天和傷后16天明顯增強，P<0.05；傷后4天和16天比較無明顯差別，P>0.05；傷后4天EGFr基因表達較傷后10天增強，P<0.05；而傷后10天EGFr基因表達又較傷后16天明顯增強，P<0.05。

3 討論

創(chuàng)面愈合是機體對外來損傷刺激而引起的一系列信號反應，其最終達到對損傷的修復，其中包括組織細胞的遷移增殖、肉芽組織的形成、細胞外基質(zhì)沉積、再上皮化等過程。在創(chuàng)傷修復中，許多種生長因子及其相關基因發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)和控制了其發(fā)展變化和結果[4]；在這些生長因子中，EGF和EGFr是很重要的生物分子，各種刺激引起EGF、EGFr基因表達后，組織中EGF、EGFr增多，促進細胞分裂增殖，加快創(chuàng)面愈合[5]。EGF通過與EGFr結合發(fā)揮作用，而EGFr也是體內(nèi)許多生長因子的共同作用途徑，對介導多種生長因子的作用起很重要的調(diào)節(jié)作用，EGF可以誘導皮膚干細胞快速定向分化，促進損傷皮膚再生[6]。

本研究表明：在人的中厚斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合過程中，EGFr基因在傷后4天、EGF基因在傷后10天均有明顯的表達，EGFr基因表達為由強到弱，傷后4天表達強度大于傷后10天，傷后10天表達強度大于傷后16天；EGF基因表達為由弱到強，再由強到弱，EGF基因表達傷后10天時較傷后4天和傷后16天明顯增強；傷后4天和16天比較無明顯差別。筆者知道：創(chuàng)面愈合過程中傷后4天，創(chuàng)緣和創(chuàng)基增殖雖不明顯，而此時EGFr基因表達可能有助于細胞EGFr蛋白的合成，細胞高含量的敏感EGFr又有助于細胞結合EGF蛋白，發(fā)揮EGF生物效應。從時相上看，EGFr基因早于EGF基因的高表達更體現(xiàn)了組織細胞在為明顯的宏觀修復做好生理和生化方面的準備。傷后10天正是細胞增殖組織修復的旺盛時期，這與EGF、EGFr基因的高強度表達也相一致；本組斷層供皮區(qū)創(chuàng)面愈合時間為18.5天，傷后16天，創(chuàng)面已大體愈合，創(chuàng)面基本上皮化，此時組織內(nèi)細胞雖仍有增殖，但EGF、EGFr基因表達已明顯減弱，創(chuàng)傷修復調(diào)控已發(fā)生很大變化。這種機體內(nèi)在的EGF、EGFr基因變化可能是皮膚組織修復“接觸性抑制”和避免過度增生的機制之一，可以看出有很強的生理意義。從表達的細胞可看出EGF、EGFr基因多表達在創(chuàng)緣和創(chuàng)基的成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、皮膚附屬上皮細胞，這些部位的細胞EGF、EGFr基因高表達就可以使局部產(chǎn)生更多的EGF、EGFr蛋白，這樣就有助于組織的修復。有人報道，將EGF和水凝膠一起做成制劑，利用水凝膠緩慢釋放特性延長EGF藥效，可以達到促進創(chuàng)面修復的作用[7]；還有人將骨髓間充質(zhì)干細胞與EGF一起制成微囊，應用于人工皮膚中觀察對創(chuàng)面愈合的影響，發(fā)現(xiàn)可以取得更有效的修復效果[8]。筆者認為：在創(chuàng)面愈合過程中，內(nèi)源性EGF、EGFr基因的表達活化，增加了組織中EGF、EGFr蛋白的含量，在促進和介導多種生長因子作用方面都會有很重要的作用。采取合理的措施，通過外在干預和內(nèi)部作用使EGF、EGFr基因和蛋白表達處于合理的狀態(tài)，對加快創(chuàng)面愈合會有很大的積極意義。

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[收稿日期]2012-07-02[修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟