王華,程太平

摘要：以雛雞作為試驗雞，在NDV IV系病毒感染的不同時間段（感染前5～6 h、感染后5～6 h、感染后18～20 h），以3個不同劑量的大黃乙醇提取物經(jīng)皮下注射和口服給藥，進(jìn)行體內(nèi)抗病毒試驗，以脾臟中NDV IV系病毒相對含量作為抗病毒作用效果。試驗結(jié)果表明，在NDV IV系病毒感染前5～6 h及感染后5～6 h，以3個不同劑量的大黃乙醇提取物處理，脾臟中NDVIV系病毒相對含量都明顯下降；而在NDVIV系病毒感染后18～20 h，以3個不同劑量的大黃乙醇提取物處理，脾臟中NDVIV系病毒相對含量下降不明顯。在NDVIV系病毒感染的適宜時間，以適宜劑量大黃乙醇提取物進(jìn)行防治具有一定療效；大黃乙醇提取物在試驗雞體內(nèi)抵抗NDVIV系病毒感染與給藥劑量及給藥時機有密切關(guān)系；大黃乙醇提取物5.0 mL·kg-1·次-1大劑量組對試驗雞是安全的。

關(guān)鍵詞：大黃乙醇提取物；三黃雞；NDVIV系病毒

中圖分類號：S792.99文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.02.008

Anti-viral Effect of Rhubarb Ethanol Extract on Newcastle Disease Virus to Chickens in Vivo

WANG Hua，CHENG Tai-ping

（College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou ，Hubei 434025, China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Antiviral experiment in vivo was did in chicks with rhubarb ethanol extracts of three different dose by subcutaneous injection and oral administration in different time periods of the NDV IV strain virus infection(5~6 h before infection,5～6 h post infection,18～20 h post infection), and antiviral effect was evaluated by relative amounts of NDV IV strain virus in the spleen. The test results showed that relative contents of NDV IV strain virus in spleen decreased obviously, the chick were treated with three different doses of rhubarb ethanol extract in 5～6 h before infection and 5～6 h post infection with the NDV IV strain virus; while in 18～20 h post infection by NDV IV strain virus, the chick were treated with three different doses of rhubarb ethanol extract, relative contents of NDV IV strain virus in spleen did not decreased obviously. The experimental results showed that the prevention had definite curative effect in infection suitable time of the NDV IV strain virus with suitable dose of rhubarb ethanol extract, and the curative effect against infection of NDV IV strain virus was connected closely with drug dosage and dosing time with rhubarb ethanol extract in experimental chickens, and rhubarb ethanol extract (5.0 mL·kg-1 body weight, large dose group) was safe to experimental chicken.

Key words: rhubarb ethanol extracts; three yellow chicken; NDV IV strain virus

大黃的某些成分具有一定的抗病毒作用，一些試驗結(jié)果表明，大黃乙醇提取物對風(fēng)疹病毒[1-2]、皰疹病毒[3-4]、新城疫病毒[5]、乙型肝炎病毒[6]等具有一定抗病毒作用。王志玉等[5]采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法研究大黃乙醇提取物對新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染的拮抗作用，0.5 g·L-1大黃乙醇提取物對NDV所致的CPE有明顯抑制作用。在畜禽病毒性疾病防治方面，特別是以畜禽個體為試驗對象，在畜禽體內(nèi)給藥來做抗病毒試驗，還未有報道，但這對于某些動物病毒性疾病的防治具有更重要意義。本研究以三黃雞作為試驗對象，以大黃乙醇提取物為試驗藥物，以NDV IV系弱毒株為感染病毒，來探討大黃乙醇提取物在雞的體內(nèi)是否對NDV具有明顯的抗感染作用，為以后大黃乙醇提取物的抗病毒防治研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1大黃乙醇提取物的制備

從藥店購買藥用大黃，按1 kg生大黃加2 L乙醇溶液（100 mL內(nèi)含有95 mL乙醇），浸泡12～16 h，85～90 ℃加熱2 h，過濾，收集濾液。將濾渣再加乙醇溶液，加入量為第一次的80%，85～90℃加熱2 h，過濾，收集濾液，合并兩次的濾液，減壓濃縮，然后自然干燥或50 ℃烘箱干燥。以滅菌的磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.05 mol·L-1、pH值7.2）稀釋大黃乙醇提取的干燥物，濃度為0.25 g·mL-1。

1.2NDV IV系弱毒的準(zhǔn)備

NDV IV系（La Sota）弱毒疫苗，武漢中博生物有限公司生產(chǎn)，批號2011092，500羽份·瓶-1，-20 ℃保存，臨用時加入滅菌過的等滲PBS（0.1 mol·L-1、pH值7.4）12 500 μL進(jìn)行稀釋，以滴鼻方式對每只試驗雞進(jìn)行接種，接種量為50 μL。

1.3試驗雞的準(zhǔn)備和接種NDV IV系弱毒

從市場上購買三黃肉雞雛雞苗300只，2日齡，用15個大紙箱分開，按肉雞飼養(yǎng)規(guī)范進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)到21日齡時，挑出弱雞苗及達(dá)不到體重標(biāo)準(zhǔn)的雞苗，將剩下的雞苗混合，挑出252只，隨機分成21個組，每組12只，第4組、第11組和第18組為對照組，其余各組為給藥組。在22日齡的中午（13時─14時），以滴鼻方式，用微量加樣槍對第1組到第21組的每只試驗雞接種NDV IV系弱毒病毒，接種量為50 μL。在飼養(yǎng)過程中，要做好衛(wèi)生及隔離，防止病原體的感染。

1.4試驗雞的給藥

試驗雞接種NDV IV系病毒前5～6 h，對第1組、第2組和第3組的試驗雞，以皮下注射方式給藥，劑量分別為1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；第4組的試驗雞，皮下注射滅菌的PBS 5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，間隔10～12 h；連續(xù)給藥8次。試驗雞接種NDV IV系病毒前5～6 h，對第5組、第6組、第7組的試驗雞，以口服方式給藥，劑量分別為1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，間隔10～12 h；連續(xù)給藥8次。

試驗雞接種NDV IV系病毒后5～6 h，對第8組、第9組和第10組的試驗雞，以皮下注射方式給藥，劑量分別為1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；第11組的試驗雞，皮下注射滅菌的PBS 5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，間隔10～12 h；連續(xù)給藥7次。試驗雞接種NDV IV系病毒后5～6 h，對第12組、第13組、第14組的試驗雞，以口服方式給藥，劑量分別為1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，間隔10～12 h；連續(xù)給藥7次。

試驗雞接種NDV IV系病毒后18～20 h，對第15組、第16組和第17組的試驗雞，以皮下注射方式給藥，劑量分別為1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；第18組的試驗雞，分別皮下注射滅菌的PBS 5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，間隔10～12 h；連續(xù)給藥6次。試驗雞接種NDV IV系病毒后18～20 h，對第19組、第20組、第21組的試驗雞，以口服方式給藥，劑量分別為1.0 ，2.5 ，5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，間隔10～12 h；連續(xù)給藥6次。

1.5 試驗雞含毒組織的采集與NDV的檢測

在NDV IV系病毒感染和治療后第4天下午，在每個組中隨機抽取5只雞，將雞致死后，采集每只雞的脾臟，在2～8 ℃保存。剪取或切取適量的（一般不超過5 g）器官和組織，稱質(zhì)量，研磨，凍融3次，加等質(zhì)量的滅菌過的等滲PBS（0.1 mol·L-1、pH值7.4，另加有5 000 IU·mL-1青霉素及5 mg·mL-1卡那霉素），充分混勻，倒入10 mL塑料離心管，低速離心，取上清液，編號，2～8 ℃保存，供檢測NDV。

以微量法病毒血凝試驗檢測每份樣品，采用V形底孔微量反應(yīng)板。微量法病毒血凝試驗的操作參考文獻(xiàn)[7]，在V形底孔微量反應(yīng)板上，一排孔只檢測一個樣品。不同之處是在第1孔中直接加一個樣品處理液25 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1各組試驗雞給藥后的表現(xiàn)

各給藥組及對照組的試驗雞，在給藥或注射PBS后，至宰殺之前沒有一只出現(xiàn)異常表現(xiàn)；宰殺之后，觀察雞的內(nèi)臟器官和組織，也沒有見到肉眼可見的病理變化。試驗結(jié)果表明，所使用的藥物是安全的，試驗藥物的劑量也沒有超過安全范圍。

2.2各組試驗雞的脾臟NDV檢測結(jié)果

以病毒血凝試驗檢測各組試驗雞的脾臟的病毒血凝效價，即樣品的原采樣組織的稀釋倍數(shù)以2X表示。某樣品的NDV血凝效價低于2，即X值小于1，就記為“-”。各表中的數(shù)字為X的對應(yīng)值，見表1至表3。各樣品的病毒血凝效價以logY進(jìn)行轉(zhuǎn)換后計算幾何平均數(shù)，Y等于2X。如果某樣品的NDV血凝效價低于2，即X值小于1，在計算幾何平均數(shù)時，該樣品的logY值記作0。

表1中，第3組和第7組的樣品檢測結(jié)果均為陰性；第2組和第6組的樣品檢測結(jié)果只有一個為1；第1組的樣品有3個為1，2個為陰性；第5組的樣品均為1，但比對照組的樣品低2個滴度。表1的結(jié)果顯示，在NDV IV系病毒感染前5～6 h，皮下注射及口服給予大黃乙醇提取物，3個劑量組對NDV IV系病毒的感染和增殖都具有明顯的抑制效果；3個劑量組，隨著劑量的增加，抑制效果也增強，5.0 mL·kg-1·次-1劑量組抑制效果最好，2.5 mL·kg-1·次-1劑量組抑制效果次之。皮下注射與口服給予比較，對NDV IV系病毒的感染和增殖的抑制效果幾乎沒有差異。

表2中，第10組和第14組的樣品檢測結(jié)果均為陰性；第8組和第12組的樣品均為1，但比對照組的樣品低2個滴度。表2的結(jié)果顯示，在NDV IV系病毒感染后5～6 h，皮下注射及口服給予大黃乙醇提取物，3個劑量組對NDV IV系病毒的感染和增殖都具有明顯的抑制效果；隨著劑量的增加，抑制效果也增強，5.0 mL·kg-1·次-1劑量組抑制效果最好，2.5 mL·kg-1·次-1劑量組抑制效果次之。皮下注射與口服給予，對NDV IV系病毒的感染和增殖的抑制效果幾乎沒有差異。

在表3中，第15組、第16組、第17組、第19組、第20組和第21組的幾何平均數(shù)很接近，相差不到1個滴度，與對照組比較，大約相差1.5個滴度。表3的結(jié)果顯示，在NDV IV系病毒感染后18～20 h，皮下注射及口服給予大黃乙醇提取物，3個劑量組對NDV IV系病毒的感染和增殖都具有一定的抑制效果，但抑制效果不明顯，沒有表1及表2的抑制效果好；3個劑量組的抑制效果幾乎無差異。

3討論

本試驗以3個不同劑量的大黃乙醇提取物進(jìn)行防治處理，經(jīng)皮下注射和口服給藥，試驗結(jié)果表明，在NDV IV系病毒感染前5～6 h及感染后5～6 h給藥處理，這3個劑量對NDV IV系病毒感染都具有明顯抵抗作用。在NDV IV系病毒感染前5～6 h及感染后5～6 h給藥處理，對NDV IV系病毒感染具有明顯抵抗作用的更低劑量還有待進(jìn)一步研究。

本試驗選取NDV IV系病毒感染的3個時間段進(jìn)行給藥處理，前2個時間段的療效與第3個時間段的療效有這樣大的差別，可能與藥物作用機制和時效、NDV IV系病毒感染和增殖的機制有密切關(guān)系。大黃乙醇提取物抗NDV IV系病毒感染和增殖的機制還不明確。大黃抗單純皰疹病毒的作用主要通過抑制該病毒的吸附和穿入過程而阻止病毒感染[3]。有研究顯示，大黃可以阻斷NDV侵入細(xì)胞和抑制病毒在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；大黃乙醇提取物在體外具有直接殺傷NDV的作用[5]。大黃乙醇提取物中蒽醌類也具有直接殺傷皰疹病毒的作用[8]。

大黃乙醇提取物在NDV IV系病毒感染后多長時間不具有明顯抗感染作用還需要作更多更詳細(xì)的研究試驗。不過，本試驗結(jié)果暗示，在NDV IV系病毒感染的最早期，使用大黃乙醇提取物進(jìn)行防治是有意義的。但對于NDV強毒毒株的感染，在感染的最早期，使用大黃乙醇提取物進(jìn)行防治是否具有明顯療效，還不確定，由于NDV強毒的感染和增殖的機制與NDV IV系病毒（為弱毒株）感染和增殖的機制是有差異的。

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