劉文浩　仇平平　辛相啟　蘇文敏　王祥　竺曉平

摘 要：2011年春季在山東泰安保護(hù)地采集疑似番茄黃化曲葉病毒病癥狀的樣品（SDTA），利用雙生病毒的通用引物及DNA-A基因的全長(zhǎng)引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，得到共2 781 bp的核苷酸序列。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該樣品與番茄黃化曲葉病毒安徽分離物（FN650807）同源性最高為996%，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，該樣品是番茄黃化曲葉病毒，屬于番茄黃化曲葉病毒以色列株系。

關(guān)鍵詞：番茄黃化曲葉病毒；DNA-A；序列分析

中圖分類號(hào)：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）11-0004-04

番茄黃化曲葉?。═omato yellow leaf curl disease，TYLCD）的病原是番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV），屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），是一類由煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播的雙生病毒。Begomovirus中大多數(shù)病毒是雙組分病毒，主要由DNA-A和DNA-B兩個(gè)組分組成，大小約為25～28 kb，少數(shù)病毒為單組分，即只有DNA-A。該病主要癥狀是植株上部葉片黃化，邊緣上卷，葉片變小，下部葉片葉脈褪綠，植株明顯矮化，不結(jié)果或結(jié)畸形果，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量。

1964年，番茄黃化曲葉病毒首次在愛爾蘭島發(fā)現(xiàn)。此后在亞洲、美洲、歐洲等地的許多國(guó)家也都有大面積的發(fā)生，目前已是熱帶和亞熱帶番茄的重要病害，成為了世界范圍內(nèi)影響番茄生產(chǎn)的首要限制因子[2～7]。自2006年以來(lái)，我國(guó)東部沿海地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病，2007年該病害在山東地區(qū)大棚中零星發(fā)生，2009年在山東省保護(hù)地中流行，病株率一般為20%～30%，嚴(yán)重的達(dá)到60%～80%，在壽光大棚番茄主產(chǎn)區(qū)，病田率高達(dá)90%以上，常導(dǎo)致大棚重播，損失嚴(yán)重[8～13]。

本研究利用雙生病毒通用引物[1]和DNA-A全長(zhǎng)引物首次對(duì)泰安地區(qū)的疑似番茄黃花曲葉病毒的感病番茄樣品進(jìn)行了檢測(cè)并對(duì)病毒分離物進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增，利用同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析等方法對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定。

1 材料與方法

11 樣品采集

于2011年1月采自泰安市泰山區(qū)保護(hù)地中表現(xiàn)典型黃化曲葉病毒病癥狀的番茄植株，采集的樣品于-20℃保存，病毒分離物命名為SDTA。

12 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

DNA提取采用北京天根公司的DNA提取試劑盒DP-305，參照說明書進(jìn)行提取，提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆?。以樣品的總DNA為模板，參考謝艷等[1]設(shè)計(jì)的雙生病毒的通用引物PA（5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′）和PB（5′-TGGACYTTRCAWJJBCCGCACA-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃ 3 min；94℃ 40 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min[1]。

測(cè)序后與GenBank上已經(jīng)登錄的序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)DNA-A的全長(zhǎng)引物TY3（5′-CAGTGGCTCGCAGAGGGT-3′）和TY5（5′-TTCGCAAGTATCAATCAAGGT-3′），擴(kuò)增DNA-A全長(zhǎng)序列。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 40 s，56℃ 1 min，72℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。以番茄黃化曲葉病毒毒源樣品的DNA作陽(yáng)性對(duì)照，以健康植株作為對(duì)照。

引物合成和序列測(cè)定均由上海博尚生物科技有限公司完成。

13 同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化

將測(cè)得的序列上傳到GenBank上，并進(jìn)行BLAST分析。選取已經(jīng)登錄的中國(guó)各地和世界各地區(qū)代表性番茄黃化曲葉病毒序列（見表1），利用DNAStar進(jìn)行同源性比對(duì)；并以番茄葉片卷曲病毒的越南分離物（TLCVV）為外組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，用Clustal W對(duì)序列進(jìn)行對(duì)比分析，用MEGA 4軟件，采用Kimura 2-parameter距離矩陣、鄰位法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支置信度（bootstrap）進(jìn)行1 000次重復(fù)分析。

2 結(jié)果與分析

21 擴(kuò)增結(jié)果及SDTA基因組DNA-A結(jié)構(gòu)特征

用引物PA、PB對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到500 bp左右的特異片段（圖1），用引物TY3、TY5對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增得到27 kb左右的特異片段（圖2），回收、測(cè)序后得到2 781 bp的序列，提交到GenBank，登錄號(hào)為JF414236。

22 與已報(bào)道的番茄黃化曲葉病毒DNA-A同源性分析

BLAST分析結(jié)果顯示，分離物SDTA的DNA-A基因全序列與番茄黃化曲葉病毒同源性最高；將其與中國(guó)不同地區(qū)和世界不同地區(qū)的雙生病毒進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，SDTA與國(guó)內(nèi)安徽地區(qū)分離物同源性最高為996%，確定為番茄黃化曲葉病毒的一個(gè)分離物。對(duì)病毒編碼的各個(gè)基因比對(duì)結(jié)果表明，分離物SDTA與杭州、安徽和天津分離物的同源性最高，均在990%以上（表1）。

為了更好地分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，選取全國(guó)不同地區(qū)有代表性的分離物以及國(guó)外其他地區(qū)引起番茄黃化曲葉病毒的分離物，以越南地區(qū)番茄葉片卷曲病毒（ToLCVV）為外組，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果表明，樣品SDTA和來(lái)自中國(guó)杭州、安徽、天津等地的分離物親緣關(guān)系較近，與美洲、亞洲等地的番茄黃化曲葉病毒同屬于以色列番茄黃化曲葉病毒以色列株系（TYLCV-IL）。3 結(jié)論與討論

按雙生病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)地區(qū)和序列的不同將番茄黃化曲葉病毒分為以下幾個(gè)株系：Tomato yellow leaf curl virus-Gezira（TYLCV-Gez）、Tomato yellow leaf curl virus–Isreal（TYLCV-IL）、Tomato yellow leaf curl virus-Mild（TYLCV- MLD）、Tomato yellow leaf curl virus-Iran（TYLCV-IR）及Tomato yellow leaf curl virus-Oman（TYLCV-OM）等[14]。由目前已報(bào)道的資料來(lái)看，TYLCV株系中以色列株系（TYLCV-IL）的分布最廣。本研究的樣品SDTA與以色列株系的同源性為977%，同屬于一個(gè)分支。根據(jù)雙生病毒科分類標(biāo)準(zhǔn)，病毒基因組核苷酸序列同源性小于89%就被定名為不同病毒，大于89%則被認(rèn)

為是同一病毒的不同株系[15]。因此，我們認(rèn)為樣品SDTA與中國(guó)東南部沿海地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒均屬于番茄黃化曲葉病毒以色列株系（TYLCV-IL）的分離物。

番茄黃化曲葉病毒不能通過摩擦傳毒，只能以煙粉虱以持久性方式傳播，由于山東等地北方保護(hù)地獨(dú)特的種植模式和種植環(huán)境，使得B型煙粉虱能夠在保護(hù)地溫暖的小氣候中越冬為害，為番茄黃化曲葉病毒的傳播和流行提供了有利條件，使得過去在國(guó)內(nèi)南方流行的該病害得以在北方保護(hù)地中發(fā)生。分離物SDTA與安徽、浙江杭州、天津分離物親緣關(guān)系最近，而且山東地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒最早在魯南地區(qū)發(fā)現(xiàn)并逐漸向魯中的濰坊、淄博一帶蔓延，因此推測(cè)山東泰安地區(qū)的病毒樣品應(yīng)該是從江浙地區(qū)經(jīng)由魯南傳播而來(lái)，再通過魯中、魯北的蔬菜產(chǎn)區(qū)向北方的河北、天津等其他地區(qū)傳播。參 考 文 獻(xiàn)：

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