馬玉花+冶貴生+馮志鵬

摘要： 對柴達木盆地梭梭的PrxQ基因進行擴增，并利用生物軟件對PrxQ基因序列進行分析，對蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。結(jié)果表明：柴達木盆地梭梭PrxQ基因長度為657 bp，編碼218個氨基酸；PrxQ蛋白親水性、二級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、信號肽、跨膜螺旋區(qū)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，柴達木盆地梭梭PrxQ蛋白亞細胞定位于葉綠體，蛋白二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲；PrxQ具有2個N-糖基化位點、7個蛋白激酶C磷酸化位點、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，此外PrxQ蛋白的親水性較強，無跨膜螺旋區(qū)。柴達木盆地梭梭PrxQ蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，PrXQ蛋白三維結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲互相盤繞而成。

關(guān)鍵詞： 梭梭；PrxQ基因；序列分析；蛋白結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S718.43 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0027-04

梭梭（Haloxylon ammodendron）為藜科（Chenopodiaceae）梭梭屬（Haloxylon Bunge）多年生小喬木，別稱瑣瑣、梭梭柴，屬強旱生植物 [1]，主要分布在我國新疆的準噶爾盆地、塔里木盆地，內(nèi)蒙古阿拉善盟、巴彥淖爾盟，甘肅的河西走廊西端，青海柴達木地區(qū)荒漠地區(qū)，生長于海拔2 700～3 000 m的半荒漠、荒漠地區(qū)的沙地，為國家瀕危三級保護植物 [2]。

柴達木盆地是我國土地鹽堿化的主要發(fā)生地區(qū)之一，由于該地區(qū)氣候高寒干燥，蒸發(fā)量大而降水量小，加上風蝕、沙化嚴重，使盆地存在著沙漠化、鹽漬化的雙重危害，嚴重制約著該區(qū)社會經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。作為柴達木盆地旱生、鹽生荒漠植被組成的主體，梭梭是當?shù)亓鲃由车刂卫淼南蠕h樹種，它不僅具有顯著的生態(tài)價值，而且具有很重要的藥用價值，因而對其研究和開發(fā)利用具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟、社會價值。

鹽脅迫導(dǎo)致的滲透脅迫和離子毒害使植物產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS濃度的提高會積累丙二醛（MDA）等有害過氧化物，造成膜脂過氧化，使ROS產(chǎn)生與清除之間的動態(tài)平衡被破壞，如果不能及時清除ROS就會造成氧化脅迫 [3]。為了防止活性氧對細胞造成傷害，植物細胞會啟動針對活性氧的清除機制。鹽脅迫下鹽生植物抗氧化酶活性高于非鹽生植物 [4]，鹽脅迫下植物體內(nèi)抗氧化酶的活性上升可清除過多的活性氧，從而保護膜系統(tǒng)不受破壞并提高植物的耐鹽性 [5-6]。

過氧化物還原酶是植物抗氧化過程中的一種酶，其分布廣泛，幾乎存在于所有植物、酵母、細菌、寄生蟲、哺乳動物等多種生物體內(nèi)，基于氨基酸序列中半胱氨酸殘基的保守性及催化機制可將植物的過氧化物還原酶分為4種：1-Cys Prx、2-Cys Prx、Ⅱ型Prx、Ⅱ型PRxQ [7-8]。過氧化物還原酶在原核生物、真核生物中都高度保守 [9]，它可以催化H2O2還原為水，或在供體氫的存在下，催化各種烷基過氧化物還原為水和相應(yīng)的醇，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)H2O2濃度參與信號傳導(dǎo) [10]。Kong等首先從佛甲草中克隆到PrxQ [11]，目前已在四翅濱藜、擬南芥、梭梭（內(nèi)蒙古阿左旗巴丹吉林沙漠）、小麥等植物中獲得了PrxQ基因 [12-15]。甘曉燕等對內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭的PrxQ基因進行了克隆和分析 [14]。由于不同生境下的植物基因具有變異性，本研究在對柴達木盆地梭梭進行PrxQ基因克隆的基礎(chǔ)上，對PrxQ基因的核苷酸序列、氨基酸序列進行分析，在此基礎(chǔ)上對PrxQ基因蛋白的亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、功能位點及跨膜區(qū)進行了預(yù)測，以期為下一步PrxQ基因的表達特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試梭梭的種子采自青海省柴達木盆地；供試土壤為園土，按1 ∶ 2的比例加入泥炭。2013年9月中旬采集梭梭的種子，經(jīng)消毒后播種到30 cm（高）×25 cm（內(nèi)徑）的花盆中，待梭梭苗木長到10 cm左右時采集位于中上部的綠色同化枝進行總RNA的提取。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000 DNA marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；植物RNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已發(fā)表的PrXQ基因序列設(shè)計引物，由大連寶生物工程有限公司合成，預(yù)期目的片段長度為657 bp。引物序列為：PrXQ-F：5′-ATGGCTACCCTCTCACTT-3′；PrXQ-R：5′-TCAAAGGCTTTGTAGAAATT-3′。

1.2.2 梭梭總RNA的提取 參照試劑盒說明提取梭梭總RNA。

1.2.3 RT-PCR 取5 μL提取的梭梭總RNA、4 μL下游引物、3 μL dNTP Mixture、3 μL RNase-Free ddH2O，70 ℃預(yù)熱 5 min，立即冰浴2 min；再分別加入4 μL 5倍的反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，置于42 ℃水浴50 min，95 ℃ 5 min；補加RNase-Free ddH2O至總體積為50 μL。將得到的cDNA于-20 ℃保存。

1.2.4 PCR擴增 取2 μL上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、5 μL 10倍的PCR緩沖液、3 μL MgCl2、4 μL dNTP、各2 μL上下游引物、05 μL Taq DNA聚合酶，加RNase-Free ddH2O至50 μL后進行擴增。PCR擴增的程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5 序列測定與分析 將擴增正確的PCR產(chǎn)物送交生物公司進行序列測定，應(yīng)用DNAStar對PrxQ基因序列進行分析，并預(yù)測PrxQ蛋白的二級結(jié)構(gòu)和親水性。用SignalP4.1進行蛋白信號肽分析，TMHMM進行蛋白跨膜螺旋區(qū)分析，PredictProtein 進行蛋白細胞定位及蛋白修飾位點分析，應(yīng)用 I-TASSER 在線服務(wù)器預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 梭梭總RNA提取

由圖1提取的梭梭總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測結(jié)果看出，RNA所在泳道目的條帶清晰，28S亮度為18S的2倍，提取的總RNA可以滿足后續(xù)試驗的要求。

2.2 梭梭PrxQ基因PCR擴增結(jié)果

將PrxQ基因的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，圖2結(jié)果表明，PrxQ基因所在泳道出現(xiàn)目的條帶，大小與預(yù)期的657 bp長度相符。

2.3 PrxQ基因核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.3.1 核苷酸序列分析 測定的PrxQ基因核苷酸序列經(jīng)DNASTAR軟件分析，表1結(jié)果表明：PrxQ基因核苷酸序列長度為657 bp，T的含量較高，達到30.59%；整個基因序列中 A+T 的含量高于G+C的含量。

2.3.2 氨基酸序列分析 推導(dǎo)的PrxQ基因氨基酸序列經(jīng)DNASTAR軟件進行分析表明，氨基酸序列長度為218個，相對分子質(zhì)量為23 977.06 u，等電點為9.317。根據(jù)表2數(shù)據(jù)計算各類氨基酸中堿性、酸性氨基酸的數(shù)量比例分別為151%、8.3%，疏水性、親水性氨基酸的數(shù)量比例分別為353%、41.3%。

2.3.3 柴達木盆地梭梭PrxQ基因與參考基因核苷酸序列、氨基酸序列的比較結(jié)果 將獲得的柴達木盆地梭梭PrxQ基因與GenBank中登錄的內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭（JN657416.1）、膠楊（Populus balsamifera，AY530803.1）、鹽角草 （Salicornia herbacea，F(xiàn)J443123.1）、佛甲草（Sedum lineare，AB037598.1）、鹽地堿蓬（Suaeda salsa，AY373447.1）、冬小麥（Triticum aestivum，JQ739147.1）、團藻（Volvox carteri，XM_002954776.1）等植物的PrxQ基因核苷酸序列、氨基酸序列進行比較。表3結(jié)果表明，所得梭梭PrxQ基因序列與非梭梭屬植物PrxQ基因序列間存在著豐富的變異，其核苷酸序列的同源性在40.5%～86.8%間，氨基酸序列同源性在 33.6%～89.3% [JP+1]間，與已登錄的梭梭PrxQ基因核苷酸序列同源性為98.8%，氨基酸序列同源性為97.7%，有一定的突變發(fā)生，可見不同來源梭梭的PrxQ基因存在著豐富的變異。

2.4.2 PrxQ蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 PredictProtein預(yù)測二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，梭梭PrxQ蛋白二級結(jié)構(gòu)主要組成為：α螺旋，占20.18%；β折疊，占23.39%；無規(guī)則卷曲，占56.42%?？梢姛o規(guī)則卷曲是梭梭PrxQ蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件。

利用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對PrxQ蛋白進行信號肽的預(yù)測，結(jié)果表明，PrxQ蛋白為非分泌蛋白，該蛋白不含信號肽。用TMHMM預(yù)測梭梭PrxQ基因跨膜區(qū)，結(jié)果顯示PrxQ蛋白不含跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)。

利用PredictProtein對PrxQ進行功能位點預(yù)測，結(jié)果表明，PrXQ具有2個 N-糖基化位點，分別為8～11位的NHTL、31～34位的NISI，其糖基化的連接點均為天冬酰胺；7個蛋白激酶C磷酸化位點，分別為19～21位的TPK、59～61位的SPR、62～64位的SYK、81～83位的TLK、144～146位的SHK、147～149位的SFK、211～213位的TLK；2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，分別為81～84位的TLKD、138～141位的SGDD。

圖4的親水性預(yù)測結(jié)果顯示，PrxQ蛋白的親水性較強，分布區(qū)域較多，主要的分布區(qū)為17～30、37～41、49～64、81～ 90、94～97、106～115、117～130、139～154、159～172、181～189、198～210位?？梢娫摰鞍子H水性較強，具有多個連續(xù)親水區(qū)。

在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用I-TASSER在線軟件對柴達木盆地梭梭PrxQ蛋白進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測。由圖5的預(yù)測結(jié)果可知：5個得分最高的PrxQ蛋白三維結(jié)構(gòu)均主要由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲互相盤繞而成，其中模型1的C-score（表示預(yù)測模型的置信度）達到了-2.51，說明所建模型可信度較高。

3 結(jié)論與討論

對于同一個物種而言，不同的生境使其具有不同的生物學特性，長期生長于高鹽環(huán)境的植物往往具有比生長于低鹽環(huán)境的植物更強的耐鹽性 [16-17]，柴達木盆地梭梭長期生長于鹽堿地中，具有很強的耐鹽性。前人對干旱區(qū)鹽生植物的生理生化研究顯示，相對于白梭梭、檉柳、胡楊、枸杞、檸條、揚柴、沙棘、沙棗等旱生植物，梭梭具有更強的耐鹽性。除了在高鹽環(huán)境中Na+的吸收、轉(zhuǎn)運、區(qū)室化作用對梭梭的生存起著關(guān)鍵作用外 [18]，抗氧化酶系統(tǒng)及時清除自由基也起著至關(guān)重要的作用。本研究通過對柴達木旱生、鹽生植物梭梭的PrxQ基因的克隆、序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測，以期為闡明柴達木盆地梭

梭耐鹽機制奠定基礎(chǔ)。

本研究獲得的柴達木盆地梭梭PrxQ基因總長657 bp，編碼218個氨基酸，序列比對分析表明：柴達木盆地梭梭PrxQ基因核苷酸序列與不同科屬植物PrxQ基因的同源性在405%～86.8%間，氨基酸序列同源性在33.6%～89.3%間；而與已發(fā)表的內(nèi)蒙古巴丹吉林沙漠梭梭PrxQ基因的核苷酸序列存在一定的差異性，其同源性為98.8%，氨基酸序列同源性為97.7%。不同地域和自然環(huán)境的梭梭不僅存在著核苷酸序列上豐富的變異，其氨基酸序列也存在著豐富的變異，從而保證了梭梭在極端環(huán)境下能夠正常生長發(fā)育。

此外通過在線分析軟件預(yù)測可知，梭梭PrxQ蛋白定位于葉綠體中，且該蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白，不含跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)，為非跨膜蛋白，且屬親水蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，無規(guī)則卷曲為梭梭PrxQ蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件。功能位點預(yù)測顯示，PrxQ具有2個 N-糖基化位點，說明柴達木盆地梭梭可能通過PrxQ蛋白的糖基化實現(xiàn)蛋白的翻譯后調(diào)控，并參與細胞信號識別等生命過程 [19]；另外含有7個蛋白激酶C磷酸化位點、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，說明梭梭PrxQ蛋白可能通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)依次控制基因表達并進行細胞的信號傳導(dǎo)。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對柴達木盆地梭梭PrxQ蛋白進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測并獲得了其三維結(jié)構(gòu)，主要由α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲互相盤繞而成。

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