王鐵霖 嚴(yán)婉榮 閆莎莎 楊玉文 趙廷昌

摘要：利用signal3.0、LipoP和TargetP對(duì)瓜類果斑病菌Acidovorax avenar subsp.citrulli AACOO-1菌株基因組中4709個(gè)ORFs進(jìn)行分析，對(duì)該病菌基因組中信號(hào)肽的數(shù)量、長(zhǎng)度和氨基酸組成進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行分類。結(jié)果確定其中476個(gè)0RFs所編碼的N-端有信號(hào)肽序列，占全部ORFs的10.10％。信號(hào)肽長(zhǎng)度為14～48個(gè)氨基酸，以20～35個(gè)氨基酸居多，26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多。組成信號(hào)肽的氨基酸中，非極性氨基酸占47.80％，極性氨基酸占23.04％，帶負(fù)電荷的酸性氨基酸占15.87％，帶正電荷的堿性氨基酸占8.73％。預(yù)測(cè)的476條信號(hào)肽中，有384條分泌型信號(hào)肽(SPI)，40條脂蛋白型信號(hào)肽(SPH)，51條TMHI型信號(hào)肽和1條CYT型信號(hào)肽。在分泌型信號(hào)肽中，有96個(gè)信號(hào)肽具有RR-motif的保守區(qū)段。

關(guān)鍵詞：Acidovorax citrulli；信號(hào)肽：分析

細(xì)菌性果斑病是發(fā)生在甜瓜、西瓜等葫蘆科植物上的一種嚴(yán)重的世界性病害。其病原是嗜酸菌屬西瓜種(Acidovorax citrulli)。此病是一種毀滅性病害，一旦發(fā)生可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2007年1月14日，US DOE Joint Genome Institute的Copeland A，Lucas S等完成對(duì)菌株Acidovorax avenoe subsp.cit-rulli AACOO-1全基因組的測(cè)序工作(NC 008752)，其中有4709個(gè)ORFs能夠編碼蛋白。

信號(hào)肽一般由10～60個(gè)氨基酸殘基組成，被1個(gè)疏水中心區(qū)(H-region)分為3個(gè)部分，即N結(jié)構(gòu)域、H結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域。疏水中心區(qū)(H-region)主要由疏水氨基酸(亮氨酸L，纈氨酸V，異亮氨酸I)構(gòu)成；C區(qū)有著更強(qiáng)的極性，這個(gè)區(qū)域極性氨基酸(蘇氨酸T，絲氨酸S等)的分布較其他2個(gè)區(qū)更多：N一末端為帶正電荷的堿性氨基酸殘基。疏水中心區(qū)根據(jù)信號(hào)肽氨基酸組成及切割位點(diǎn)信號(hào)肽識(shí)別序列的不同，將信號(hào)肽分為信號(hào)肽酶I型(SPI)、信號(hào)肽酶Ⅱ型(SPII)、CYT型信號(hào)肽及TMHI型信號(hào)肽4種類型。

Signal基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法和隱馬可夫模型2種算法預(yù)測(cè)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)：LipoP以預(yù)測(cè)SPII型為主，即脂蛋白的數(shù)量、切割位點(diǎn)及切割位點(diǎn)后+2位上氨基酸的種類，同時(shí)根據(jù)分析可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的類型；TargetP主要預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)。這3種軟件雖然各有側(cè)重。但它們所得到的結(jié)果卻有很大的相關(guān)性，經(jīng)證明對(duì)于信號(hào)肽預(yù)測(cè)，蛋白質(zhì)功能和蛋白質(zhì)分泌位點(diǎn)的預(yù)測(cè)簡(jiǎn)單且較為可靠。

本研究利用這3種計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)方法對(duì)植物病原細(xì)菌Acidovorax avenae subsp.citrulli AACOO-1全基因組進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

從NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008752)上獲得Acidovorax avenae subsp.citrulliAACOO-1的全基因組序列、ORFs的功能注釋等相關(guān)信息。

1.2預(yù)測(cè)方法

利用http：//www.cbs.dtu.dk/services提供的Sig-nal 3.0、TargetP 1.01和LipoP 1.0分析Acidovoraxavenae subsp.citrulli AACOO-1菌株基因組中全部ORFs的N端氨基酸序列。

(1)Signal 3.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在Gram-negative bacteria狀態(tài)下預(yù)測(cè)所有ORFs的N端氨基酸序列，預(yù)測(cè)是否存在信號(hào)肽。記錄神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法獲得每個(gè)ORF的Cmax值、Ymax值、Smax值、Smean值、D值及其位點(diǎn)和應(yīng)用隱馬可夫模型的Cmax值及Sprob值。根據(jù)軟件的默認(rèn)選擇，將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法分析獲得D值>0.44和隱馬可夫模型獲得的Cmean值>0.5的ORFs確定為具有信號(hào)肽的ORFs。同時(shí)，以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法分析獲得Ymax的切割位置作為切割位點(diǎn)。

(2)LipoP 1.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)分析N端氨基酸序列，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)類型。

(3)TargetP 1.0.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析Acidovorax avenae subsp.citrulli AACOO-1預(yù)測(cè)分泌蛋白所到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

將從Signal，LipoP和TargetP中獲取的數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

綜合Signal，LipoP和TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)Aci-dovorax avenae subsp.citrulli AACOO-1編碼蛋白基因序列分析結(jié)果如下：

2.1信號(hào)肽數(shù)量和長(zhǎng)度

經(jīng)預(yù)測(cè)，有476個(gè)ORFs具有信號(hào)肽，占全部ORFs的10.10％。信號(hào)肽所在的ORFs長(zhǎng)度最小為14個(gè)氨基酸殘基，最大為971個(gè)氨基酸殘基，平均303個(gè)氨基酸殘基，ORFs分布在301-400個(gè)氨基酸范圍內(nèi)數(shù)量最多，201～300個(gè)氨基酸范圍內(nèi)數(shù)量次之，100-400個(gè)氨基酸共占總數(shù)的76.89％(圖1)。信號(hào)肽長(zhǎng)度在14～48個(gè)氨基酸之間，以20～35個(gè)氨基酸居多，其中長(zhǎng)度為26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多，共34條，占7.14％(圖2)。

2.2信號(hào)肽氨基酸組成

對(duì)組成信號(hào)肽的氨基酸種類作了系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)分析(表1)，發(fā)現(xiàn)組成信號(hào)肽的氨基酸中非極性氨基酸占47.80％，極性氨基酸占23.04％：帶負(fù)電荷的酸性氨基酸占15.87％，帶正電荷的堿性氨基酸占8.73％；含量最多的3種氨基酸依次為丙氨酸(A)、亮氨酸(L)和絲氨酸(S)，最少的氨基酸是谷氨酸(E)；在切割位點(diǎn)-1端的氨基酸中85.8％均為丙氨酸(A)，在切割位點(diǎn)+1～+3位中最多的氨基酸也是丙氨酸(A)。

2.3氨基酸種類分析

經(jīng)LipoP分析，根據(jù)信號(hào)肽氨基酸組成及切割位點(diǎn)信號(hào)肽識(shí)別序列的不同將信號(hào)肽分為4種類型：信號(hào)肽酶I型(SPI)、信號(hào)肽酶Ⅱ型(SPII)、CYT型及TMHI型信號(hào)肽。其中384條SPI型信號(hào)肽，40條SPH型信號(hào)肽，51條TMHI型信號(hào)肽和1條CYT型信號(hào)肽。

2.3.1信號(hào)肽酶I型(SPI型)

2.3.1.1分泌類信號(hào)肽(Sec-type) Sec-type的典型結(jié)構(gòu)：N-端由2～3個(gè)帶正電荷的氨基酸(K或R)組成，也有的由5～11個(gè)帶正電荷的氨基酸組成。H-domain由平均19個(gè)氨基酸構(gòu)成。C-domain(切

割位點(diǎn)前3位的氨基酸)典型結(jié)構(gòu)為A-X-A(A為丙氨酸，X指任意一種氨基酸)。在預(yù)測(cè)分析的384條SPI型信號(hào)肽中，有265條在C-domain中出現(xiàn)A-X-A典型結(jié)構(gòu)，信號(hào)肽長(zhǎng)度在16～50個(gè)氨基酸，其所在ORFs的長(zhǎng)度在62～762個(gè)氨基酸。根據(jù)TargetP的結(jié)果確定，其分泌途徑及亞細(xì)胞位點(diǎn)為s的(即分泌到周質(zhì)空間)占87.32％，m的(即分泌到線粒體中)占9.76％，未確定分泌位點(diǎn)的占2.92％。

2.3.1.2 RR-motif信號(hào)肽RR-motif類信號(hào)肽是指在信號(hào)肽中含有RR-X-##(X為任意氨基酸，##指疏水氨基酸)的保守序列。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)96個(gè)信號(hào)肽具有RR-motif保守區(qū)段信號(hào)肽長(zhǎng)度在20～45個(gè)氨基酸之間。在##中，亮氨酸(L)出現(xiàn)的頻率最高，占32.29％。其中有67個(gè)信號(hào)肽在C-domain(切割位點(diǎn)前3位的氨基酸，即-3～-1位)中出現(xiàn)A-X-A典型結(jié)構(gòu)(表2)。根據(jù)TargetP的結(jié)果確定分泌蛋白的分泌途徑及所到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)為s的占46.27％，m的占52.23％，未確定的占1.49％。

2.3.2脂蛋白型信號(hào)肽SPII型分泌蛋白信號(hào)肽也稱為脂蛋白信號(hào)肽，其典型結(jié)構(gòu)C-domain為：L-(A/S)-(A/G)，在切割位點(diǎn)后+1位氨基酸為半胱氨酸(C)，這樣就形成了保守的L-(A/S)-(A/G)-C的Li-pobox典型結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)使脂蛋白被切割后依然能夠錨定在質(zhì)膜上。該類信號(hào)肽通常比分泌型信號(hào)肽短。通過(guò)分析預(yù)測(cè)有40條脂蛋白型信號(hào)肽(表3)，其長(zhǎng)度在14～33個(gè)氨基酸之間，信號(hào)肽-1～-3位出現(xiàn)的氨基酸種類按數(shù)量多少依次為丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(s)和蛋氨酸(M)。其中具Li-pobox典型結(jié)構(gòu)的信號(hào)肽有23個(gè)，共占脂蛋白類信號(hào)肽的57.50％，其酶切位點(diǎn)的-1～-3位字體加粗表示。酶切割位點(diǎn)-1位上的丙氨酸占40.00％，-3位上的亮氨酸占85.00％。

2.3.3 TMHI型信號(hào)肽和CYT型信號(hào)肽經(jīng)預(yù)測(cè)，有51條TMH I型信號(hào)肽蛋白，占全部基因組的1.08％，長(zhǎng)度在19-40個(gè)氨基酸之間：有1條CYT型切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值表示為Smean和Dscore；后者主要是對(duì)該氨基酸序列是否具有信號(hào)肽進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，同時(shí)也對(duì)信號(hào)肽切割位點(diǎn)及分布進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值表示為Cmax。這幾個(gè)重要參數(shù)在信號(hào)肽的判斷上存在著一定的差異。為了保證結(jié)果的可靠性，選用上述參數(shù)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以便提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，利用不同軟件對(duì)同一基因組進(jìn)行分析，其結(jié)果也會(huì)有所差異，例如。用Signal3.0對(duì)全基因組預(yù)測(cè)有478條

信號(hào)肽。而用LipoP軟件預(yù)測(cè)為476條，Aave-0814(ref 969186)和Aae-4152(ref 972467)沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，并且信號(hào)肽長(zhǎng)度預(yù)測(cè)也略有不同。這也是由于不同軟件所使用的算法不同。因此，通過(guò)多種軟件同時(shí)對(duì)1個(gè)基因組蛋白進(jìn)行嚴(yán)格篩選分析，可有效提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，

用TargetP分析Acidovorax avenar subsp.citrulliAACOO-1信號(hào)肽分泌蛋白亞細(xì)胞器分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，分泌蛋白的分泌途徑及所到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)為S型分泌途徑，即分泌到周質(zhì)空間中占87.32％，M型分泌途徑，即分泌蛋白位于線粒體的占9.76％。未確定的占2.92％。S型分泌途徑占有較大比例，這反映了“革蘭氏陰性菌分泌蛋白通常直接分泌到周質(zhì)空間和細(xì)胞膜外”理論的正確性。

4.結(jié)論

瓜類細(xì)菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp.citrulli AACOO-1作為一種重要的植物病原細(xì)菌，基因組中保留如此眾多的潛在分泌蛋白，表明該類蛋白具有重要的生理功能。本實(shí)驗(yàn)利用Signal 3.0、LipoP和TargetP對(duì)瓜類果斑病菌Acidovorax avenaesubsp.citrulli AACOO-1菌株基因組中4709個(gè)ORFs進(jìn)行分析，對(duì)該病菌基因組中信號(hào)肽的數(shù)量、長(zhǎng)度和氨基酸組成進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行了分類。證實(shí)這些蛋白中哪些是真正的分泌蛋白。在什么條件下分泌哪些蛋白到菌體外。并分析分泌到菌體外的蛋白在與寄主、環(huán)境互作中有什么作用，有助于更完整系統(tǒng)地研究該病原菌的基因組特性，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步了解該病原菌的生物學(xué)特性、致病性，以及病原與寄主的互作等特性也很有幫助。