孫緒丁 劉玉芹 任松鵬 李 麗

HPLC法測(cè)定青鵬軟膏中亞大黃的含量

孫緒丁 劉玉芹 任松鵬 李 麗

目的建立藏藥青鵬軟膏中亞大黃的三種蒽醌類成分大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的高效液相色譜法（HPLC）含量測(cè)定方法。方法Waters C18色譜柱（250mm×4.6mm,5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（87:13）；流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 430nm，柱溫為室溫。結(jié)果大黃素在 3.24μg/ml～32.4μg/ml，大黃酚在 3.36μg/ml～33.6μg/ml，大黃素甲醚1.78μg/ml～17.8μg/ml濃度范圍內(nèi)均與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.9996、0.9998、0.9991；大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為 98.87%、98.12%、97.67%，RSD分別為 1.57%(n=6)、1.81%(n=6)、1.24%(n=6)。結(jié)論本方法可同時(shí)測(cè)定制劑中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，可用于青鵬軟膏的質(zhì)量控制。

青鵬軟膏；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；HPLC；含量測(cè)定

青鵬軟膏由棘豆、亞大黃、鐵棒錘、訶子（去核）、毛訶子、余甘子、安息香、寬筋藤、人工麝香等九味藏藥制成的藏藥成方制劑，具有止痛消腫的作用，用于痛風(fēng)、濕痹、“岡巴”、“黃水”病等引起的腫痛發(fā)熱、皰疹、瘟癘發(fā)燒等。亞大黃為該制劑處方中的君藥，其含有的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等蒽醌類成分具有很強(qiáng)的藥理活性[1]，因此對(duì)方中亞大黃的蒽醌成分的控制變得尤為重要?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[2]沒(méi)有對(duì)亞大黃中的蒽醌類成分進(jìn)行含量測(cè)定，文獻(xiàn)也尚未見關(guān)于青鵬軟膏亞大黃中的蒽醌成分HPLC法含量測(cè)定的報(bào)道。為了有效控制該制劑的質(zhì)量，本文首次建立了青鵬軟膏中亞大黃的三種蒽醌類成分大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的 HPLC含量測(cè)定方法，方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法具有分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，能夠更加有效的控制青鵬軟膏的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

L-2100型日立高效液相色譜儀（日立公司），

包括日立L-2100泵，日立L-2400紫外檢測(cè)器；島津 AUW220D電子天平（島津公司）；KQ-300B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州榮冠實(shí)驗(yàn)儀器分析廠）。

大黃素對(duì)照品（批號(hào)為 110756-200100，供含量測(cè)定用）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)為110796-201017，供含量測(cè)定用）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)為110758-201013，供含量測(cè)定用）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；青鵬軟膏（青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司），生產(chǎn)批號(hào)分別為20110512、20110513、20110514；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品溶液制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1ml含大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品各80μg，大黃素甲醚40μg的溶液，分別精密量取上述對(duì)照品溶液各2ml，至10ml容量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，混勻，即得（即每1ml中含大黃素、大黃酚各16μg，含大黃素甲醚8μg）。

2.1.2供試品溶液的制備取青鵬軟膏3g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲 40min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加體積百分比為8%鹽酸溶液10ml，超聲2min，再加三氯甲烷10ml，加熱回流1h，放冷，置分液漏斗內(nèi)，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶液至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備取處方組成中除亞大黃外的其余成分按制劑工藝制成不含亞大黃的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法同法處理得陰性對(duì)照溶液。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱為Waters C18柱（250mm×4.6mm,5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（87:13），流速為 1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)430nm，柱溫為室溫；分別取大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于 3000；拖尾因子在0.95～1.05，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時(shí)間分別約為 7.6min、10.6min、14.3min，三種成分與其它組分的分離度均＞1.5；陰性對(duì)照樣品不干擾樣品測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品貯備液（大黃素含量為32.4μg/ml、大黃酚含量為33.6μg/ml，大黃素甲醚含量為17.8μg/ml）1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分別置 10ml容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，各精密進(jìn)樣10μl，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰峰面積（A）對(duì)對(duì)照品濃度（C）進(jìn)行線性回歸。試驗(yàn)結(jié)果：大黃素的回歸方程為 A=10637C－8283.7，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，線性范圍為3.24μg/ml～32.4μg/ml；大黃酚的回歸方程為 A=13835C－8284.0，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，線性范圍為3.36μg/ml～33.6μg/ml；大黃素甲醚的回歸方程為 A=5017.5C－2270.8，相關(guān)系數(shù)r=0.9991，線性范圍為1.78μg/ml～17.8μg/ml。結(jié)果表明：大黃素、大黃酚、大黃素甲醚三種成分分別在3.24μg/ml～32.4μg/ml、3.36μg/ml～33.6μg/ml、1.78μg/ml～17.8μg/ml濃度范圍內(nèi)與色譜峰峰面積線性關(guān)系良好。

2.4精密度試驗(yàn)精密吸取濃度為 16.2μg/ml、16.8μg/ml、8.9μg/ml的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚混合對(duì)照品溶液 10μl，注入液相色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜峰峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。試驗(yàn)結(jié)果：大黃素對(duì)照品色譜峰峰面積的平均值為168536，RSD=1.025%；大黃酚對(duì)照品色譜峰峰面積的平均值為226015，RSD=0.93%；大黃素甲醚對(duì)照品色譜峰峰面積的平均值為39758，RSD=1.67%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取青鵬軟膏樣品（批號(hào)為20110512）按照“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，取供試品溶液，精密吸取 10μl，注入液相色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以后每隔2h測(cè)定一次，考察8h，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD。試驗(yàn)結(jié)果：供試品溶液中，大黃素色譜峰峰面積的平均值為53844，RSD=0.65%；大黃酚色譜峰峰面積的平均值為57074，RSD=1.47%；大黃素甲醚色譜峰峰面積的平均值為 13742，RSD=1.22%。結(jié)果表明：供試品溶液中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在8h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批青鵬軟膏樣品（批號(hào)為20110512）6份，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。試驗(yàn)結(jié)果：樣品中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量平均值分別為0.120mg/g、0.115mg/g、0.062mg/g，RSD分別為1.76%、1.52%、1.28%。結(jié)果表明：該分析方法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取已知含量的青鵬軟膏樣品（批號(hào)為20110512，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量分別為 0.120mg/g、0.115mg/g、0.062mg/g）6份，置具塞的錐形瓶中，各精密加入混合對(duì)照品溶液（大黃素含量為16.2μg/ml、大黃酚含量為 16.8μg/ml，大黃素甲醚含量為 8.9μg/ml）10ml和甲醇 40ml，按“2.1.2”項(xiàng)下的供試品制備方法制成供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。試驗(yàn)結(jié)果：供試品中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為98.87%、98.12%、97.67%，RSD分別為1.57%、1.81%、1.24%。結(jié)果表明該測(cè)定方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確（見表1、2、3）。

表1 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 大黃酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 大黃素甲醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8樣品含量測(cè)定取青鵬軟膏三批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液（大黃素含量為16.2μg/ml，大黃酚含量為16.8μg/ml，大黃素甲醚含量為8.9μg/ml）和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算供試品中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，結(jié)果見表4。

表4 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

參考蒽醌類成分含量測(cè)定文獻(xiàn)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定青鵬軟膏中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。于是取大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品混合溶液，于190～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明混合對(duì)照在430nm波長(zhǎng)處有較大吸收，根據(jù)紫外吸收?qǐng)D譜選定430nm為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青鵬軟膏中亞大黃的三種蒽醌類成分均得到很好的色譜分離，且在此波長(zhǎng)下檢出雜質(zhì)較少。

大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等蒽醌類成分是亞大黃的主要活性成分，根據(jù)蒽醌類化合物的性質(zhì)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，試驗(yàn)中以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚為考察指標(biāo)，對(duì)供試品溶液的制備進(jìn)行了方法學(xué)研究：考察了不同提取溶劑乙醇、甲醇、三氯甲烷，不同提取方法超聲與加熱回流，不同提取時(shí)間30min、40min、50min，不同萃取溶劑乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷的提取效率。結(jié)果顯示，采用甲醇超聲提取 40min，酸水溶解后三氯甲烷萃取能夠?qū)⑶帙i軟膏中亞大黃的三種蒽醌類成分大黃素、大黃酚、大黃素甲醚提取完全。

目前文獻(xiàn)中沒(méi)有關(guān)于亞大黃中蒽醌類成分HPLC含量測(cè)定的報(bào)道。選擇色譜條件時(shí)，參考HPLC法測(cè)定蒽醌類成分相關(guān)文獻(xiàn)，選擇甲醇-磷酸體系作為檢測(cè)青鵬軟膏中亞大黃的三種蒽醌類成分大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的流動(dòng)相，而且甲醇-0.1%磷酸(70～90:10～30)均能達(dá)到含量檢查要求，其中以甲醇-0.1%磷酸(87:13)條件下效果最好，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時(shí)間分別約為7.6min、10.6min、14.3min，三種成分與其它組分分離度均大于1.5，峰形較好，可用青鵬軟膏的質(zhì)量控制。

[1]劉斌,鞏鴻霞,肖學(xué)鳳,等.決明子化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2010,33(4):312-315.

[2]傅興圣,陳菲,劉訓(xùn)紅,等.大黃化學(xué)成分與藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2011,20(16):1534-1538.

HPLC method for the determination of Qingpeng ointment of Rhubarb in Central Asia

Sun Xuding Liu Yuqin Ren Songpeng Li Li

ObjectiveTo establish Tibetan Qingpeng ointment in three of rhubarb anthraquinone ingredient emodin,chrysophanol physcion,high performance liquid chromatography ( HPLC ) content determination method.MethodsWaters C18 column ( 250mm ×4.6mm,5μm ),mobile phase of methanol -0.1% phosphoric acid ( 87∶13 ); the flow rate was 1.0ml/min,the detection wavelength was 430nm,column temperature was at room temperature.ResultsEmodin in 3.24μg/ml～32.4μg/ml,Chrysophanol in 3.36μg/ml～33.6μg/ml,physcion in 1.78μg/ml～17.8μg/ml concentration range and chromatographic peak area showed a good linear relationship,the correlation coefficient r are respectively 0.9996,0.9998,0.9991; emodin,chrysophanol emodin monomethyl ether,the average recoveries were 98.87%,98.12%,97.67%,RSD were 1.57% (n=6 ),1.81% (n=6 ),1.24% (n=6 ).ConclusionThis method can be simultaneously determined in preparation of emodin,chrysophanol,physcion,can be used for the quality control of Qingpeng ointment.

Qingpeng ointment; Emodin;Chrysophanol; Emodin monomethyl ether; HPLC; Content determination of

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