魏美燕，李尚德，袁寧寧，梁麗萍，佘志剛，林永成

(1.廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東 東莞 523808；2.廣州工程技術(shù)職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510075；3.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

紅樹(shù)林為分布于熱帶亞熱帶潮間帶的木本植物群落，是海洋環(huán)境中特有的高等植物。由于紅樹(shù)林具有獨(dú)特的生理生態(tài)，使其具有獨(dú)特的代謝過(guò)程，代謝產(chǎn)物和獨(dú)特的共生菌，這些共生菌同樣能產(chǎn)生極其豐富的新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，紅樹(shù)林內(nèi)生真菌已經(jīng)被證明是活性海洋天然產(chǎn)物的重要來(lái)源[1]。本研究小組在開(kāi)展紅樹(shù)林內(nèi)生真菌活性物質(zhì)研究的近十幾年來(lái)，已經(jīng)對(duì)中國(guó)南海紅樹(shù)林內(nèi)生真菌進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從中分離獲得了一系列結(jié)構(gòu)新穎的或藥理活性良好的海洋天然化合物[2-8]。

海洋黑孢屬Nigrosporasp.真菌是產(chǎn)生活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要來(lái)源之一，目前已經(jīng)從中分離獲得了一系列活性化合物。如，從Nigrosporasp.PSU-F5發(fā)現(xiàn)的Epoxydons and Pyrone類化合物[9]，從Nigrosporasp.(strain No.1403)中獲得的griseofulvin類衍生物[10]，從Nigrosporasp.YB-141中發(fā)現(xiàn)的抗真菌活性化合物solanapyrones[11]，以及從Nigrosporaoryzae中分離獲得的抗細(xì)菌活性化合物Nigrosporins A and B[12]。

在研究紅樹(shù)內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中，對(duì)一株湛江紅樹(shù)內(nèi)生真菌Nigrosporasp.在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工培養(yǎng)發(fā)酵150 L。本文首次研究了該菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，從培養(yǎng)液的乙酸乙酯提取物中分離得到3個(gè)單體化合物，通過(guò)波譜解析以及文獻(xiàn)對(duì)照，分別鑒定為Griseofulvin(1)，Vermixocin B(2)，Tenellic acid A(3),見(jiàn)圖1?；衔?的結(jié)構(gòu)還通過(guò)X射線單晶衍射進(jìn)一步確定其絕對(duì)構(gòu)型,見(jiàn)圖2。體外細(xì)胞毒活性測(cè)試表明，化合物1具有中等的細(xì)胞毒活性，對(duì)人口腔表皮樣癌(鱗癌)細(xì)胞KB，人口腔鱗癌多藥耐藥細(xì)胞KBV200，和人肺腺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞毒活性IC50分別為8.23,9.10,和14.26 μmol/L。

圖1 化合物1,2,3的結(jié)構(gòu)式

圖2 化合物1的單晶衍射結(jié)構(gòu)圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與實(shí)驗(yàn)儀器

美國(guó)Varian公司INOVA 300NB超導(dǎo)核磁共振儀；英國(guó)VG公司ZAB-HS質(zhì)譜儀；美國(guó)Thremo公司LCQ DECA XP質(zhì)譜儀；北京泰克儀器公司的X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)試儀；德國(guó)Bruker公司SMART 1000 CCD X-單晶衍射儀測(cè)定。所用試劑均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，化學(xué)純?nèi)軇┙?jīng)重蒸后使用。柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)的200 ～ 300目硅膠，硅膠H，薄層硅膠GF254。

1.2 菌種及其保存條件

海洋真菌Nigrosporasp.從湛江紅樹(shù)林植物中分離得到，菌種由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院提供，保存在4℃下的玉米海水瓊脂營(yíng)養(yǎng)基中。

1.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

采用懸浮培養(yǎng)方式：發(fā)酵培養(yǎng)基(w)為葡萄糖1.0％,蛋白胨0.2％,酵母膏0.1％,粗海鹽0.25％,pH 7.0。500 mL三角瓶，內(nèi)裝培養(yǎng)液300 mL，經(jīng)121 ℃(0.1 MPa)高溫滅菌25 min后在超凈工作臺(tái)上接種，共接種150 L，28 ℃靜置培養(yǎng)30 d。

1.4 提取分離

發(fā)酵液用紗布過(guò)濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液由150 L濃縮至3 L后，用相同體積的乙酸乙酯提取。乙酸乙酯提取液濃縮后所得浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚—乙酸乙酯—甲醇梯度淋洗。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析和重結(jié)晶純化后得到化合物1(62.5 mg)，2(30.6 mg)，3(5.3 mg)。

1.5 細(xì)胞毒活性測(cè)定

化合物的細(xì)胞毒活性測(cè)定按照MTT法進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.6 化合物的X-ray 單晶衍射測(cè)定

晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)采用德國(guó)Bruker公司SMART 1000 CCD X-單晶衍射儀測(cè)定，以石墨單色化的Mo-Kα輻射(λ=0.071 073 nm)在294(2)K收集數(shù)據(jù)。在3.17°<θ<27.54°范圍內(nèi)收集衍射點(diǎn)，衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)吸收校正。結(jié)構(gòu)用Siements SHELXTL97程序計(jì)算，以直接法解析，以差值傅立葉合成法定出非氫原子坐標(biāo)，并以各向異性熱參數(shù)用全矩陣最小二乘法對(duì)其進(jìn)行修正。氫原子坐標(biāo)由理論方法獲得，并參與結(jié)構(gòu)因子計(jì)算。

2 化合物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.1 化合物的物理和波譜數(shù)據(jù)

化合物(1):白色固體，θmp224 ℃。FABMSm/z353 [M+1]+，355 [M+2+1]+。1H NMR(CDCl3,300 MHz)δH∶6.11(1H，s)，5.51(1H，s)，4.02(3H，s)，3.97(3H，s)，3.62(3H，s)，3.01(1H，dd，16.2，4.5)，2.44(1H，m)，2.40(1H，dd，16.2，4.5)，0.96(3H，d，6.6)；13C NMR(CDCl3,75 MHz)δC∶ 196.9(C)，192.4(C)，170.7(C)，169.5(C)，164.6(C)，157.7(C)，105.5(CH)，104.8(C)，97.2(C)，90.7(C)，89.4(CH)，57.0(CH3)，56.6(CH3)，56.3(CH3)，40.0(CH2)，36.5(CH)，14.2(CH3)。單晶結(jié)構(gòu)為四方晶系，空間群為P4(1)，a= 0.897 56(4)nm，b=0.897 56(4)nm，c=1.989 70(17)nm，α= 90°,β= 90°,γ= 90°,C17H16Cl O6,Mr= 351.75,V = 1.602 93(17)nm3,Z= 4,Dc= 1.458 Mg/m3,F(000)= 732,μ= 0.269 mm-1,R1 = 0.0353,wR2 = 0.0928， 5360個(gè)可觀察衍射點(diǎn)(I> 2σ(I))。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]數(shù)據(jù)基本吻合，確定化合物(1)為Griseofulvin。

Vermixocin B(2): 無(wú)色油狀，ESI-MSm/z: [M-H]-413.2。1H NMR(CDCl3,300 MHz)δH: 6.87(1H,d,J= 8.7 Hz,H-1),7.44(1H,d,J= 8.7 Hz,H-2),5.10(1H,brd,H-7),5.01(1H,d,J= 14.2 Hz,H-7),6.37(1H,d,J= 1.4 Hz,H-8),6.84(1H,d,J= 1.4 Hz,H-10),4.02(3H,s,4-OCH3),2.23(3H,s,9-CH3),2.06(3H,s,-OCOCH3),6.11(1H,dd,J= 9.6,4.6 Hz,H-1’),1.76(1H,ddd,J=14.2,9.6,5.5 Hz,H-2’),1.49(1H,ddd,J=13.3,8.2,4.1 Hz,H-2’),1.63(1H,m,H-3’),0.94(3H,d,J= 6.4 Hz,H-4’),0.94(3H,d,J= 6.4 Hz,H-5’);13C NMR(CDCl3,75 MHz)δC: 117.8(CH,C-1),130.9(CH,C-2),134.4(-C,C-3),154.8(-C,C-4),69.2(CH2,C-7),121.0(CH,C-8),135.3(-C,C-9),117.9(CH,C-10),147.5(-C,C-11),167.4(-C,C-4a),126.0(-C,C-7a),141.4(-C,C-11a),151.7(-C,C-12a),121.0(-C,C-4a),68.9(CH,C-1’),170.5(-C,C-6’),62.9(CH3,C-4-OCH3),45.5(CH2,C-2’),25.1(CH,C-3’),23.3(CH3,C-4’),22.1(CH3,C-5’),21.4(CH3,9-CH3),21.0(CH3,C-7’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]數(shù)據(jù)基本吻合，確定化合物(2)為Vermixocin B。

Tenellic acid A(3):無(wú)色晶體，ESI-MSm/z:[M-H]-401.3。1H NMR(Acetone-d6,300 MHz)δH: 7.33(d,8.6,H-4),6.49(d,8.6,H-5),4.56(dd,9.1,3.9,H-8),1.61(ddd,14,9.1,5.2,H-9),1.32(ddd,14,8.6,3.9,H-9),1.78(m,H-10),0.94(d,6.6,H-11),0.90(d,6.6,H-12),3.93(s,H-13),3.14(s,H-14),7.17(m,H-4’),7.21(m,H-6’),10.2(s,H-7’),2.36(s,H-8’).13C NMR(Acetone-d6,75 MHz)δC: 119.5(C-1),156.8(C-2),131.8(C-3),129.8(C-4),111.5(C-5),156.1(C-6),167.6(C-7),76.0(C-8),47.8(C-9),25.6(C-10),23.7(C-11),22.2(C-12),63.2(C-13),56.7(C-14),130.8(C-1’),143.0(C-2’),151.2(C-3’),124.8(C-4’),137.8(C-5’),120.2(C-6’),189.8(C-7’),20.9(C-8’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)基本吻合，確定化合物(3)為 Tenellic acid A

2.2 化合物的細(xì)胞毒活性

對(duì)化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測(cè)試。結(jié)果表明，化合物1具有中等的細(xì)胞毒活性，對(duì)人口腔表皮樣癌(鱗癌)細(xì)胞KB，人口腔鱗癌多藥耐藥細(xì)胞KBV200和人肺腺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞毒活性IC50分別為8.23,9.10 和14.26 μmol/L。

3 結(jié) 論

本文首次研究了一株紅樹(shù)內(nèi)生真菌Nigrosporasp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物。從該菌培養(yǎng)液的乙酸乙酯相中分離獲得3個(gè)聚酮類化合物：Griseofulvin(1)，Vermixocin B(2)，和Tenellic acid A(3)。細(xì)胞毒活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)化合物1具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性?；衔颎riseofulvin曾作為多種真菌的代謝產(chǎn)物報(bào)道過(guò)，最近也有報(bào)道從Nigrosporasp.中發(fā)現(xiàn)。化合物2有報(bào)道從真菌Guignardiasp.和Penicilliumsimplicissimum中發(fā)現(xiàn)過(guò)，化合物3曾作為真菌Dendrosporatenella的代謝產(chǎn)物報(bào)道過(guò)，這兩個(gè)化合物均為首次從真菌Nigrosporasp.中發(fā)現(xiàn)。紅樹(shù)林區(qū)具有豐富的內(nèi)生微生物，對(duì)紅樹(shù)內(nèi)生微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從中篩選結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，可成為海洋藥物開(kāi)發(fā)以及藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)和源泉。

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