田元新,張賢祚， 安林坤

(1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510515；3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

抗血管生成療法——阻斷實(shí)體瘤血管內(nèi)皮增殖這一關(guān)鍵步驟，一直是藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。血管的發(fā)生和生成對(duì)于早期胚胎發(fā)育以及包括腫瘤、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的一系列疾病過(guò)程至關(guān)重要[1]，其確切的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未被研究清楚。目前通常認(rèn)為與血管生成過(guò)程密切相關(guān)的有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF及其受體系統(tǒng)和血管生成素及其受體酪氨酸激酶Tie-2系統(tǒng)。VEGF及其受體VEGFR(主要是VEGFR2)可介導(dǎo)中胚層細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化并移行至血管內(nèi)皮處；而血管生成素系統(tǒng)則與血管生成晚期血管重構(gòu)、成熟過(guò)程中的細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用有關(guān)[2-3]。因此，有效地一并阻斷兩者可能收獲比單一阻斷療法更滿意的療效[4-5]?；贑EP-7055設(shè)計(jì)的一系列吲哚咔唑類化合物對(duì)VEGFR2和Tie-2均有抑制作用，目前已有藥物處于臨床應(yīng)用前階段，部分處于臨床活性評(píng)價(jià)階段[6-10]。該類Tie-2/VEGFR2雙位點(diǎn)抑制劑的3D-QSAR和體外活性已被證實(shí)，但與兩類受體結(jié)合機(jī)制的異同尚未明確。

本研究以現(xiàn)有多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑吲哚咔唑類小分子[6-10]，以及VEGFR2、Tie-2的結(jié)構(gòu)為出發(fā)點(diǎn)[11]，利用分子對(duì)接技術(shù)研究抑制劑分子與VEGFR2/Tie-2結(jié)合的復(fù)合三維結(jié)構(gòu)模型[12-14]，微觀闡明它與受體蛋白Tie-2及VEGFR2的相互作用模式，通過(guò)研究他們和受體蛋白相互作用的異同，分析配體結(jié)構(gòu)和與Tie-2、VEGFR2間結(jié)合活性差異的關(guān)系，為設(shè)計(jì)新型高效多靶點(diǎn)抑制劑化合物提供理論指導(dǎo)。

1 研究方法

1.1 小分子的構(gòu)建

從Tie-2的蛋白質(zhì)結(jié)晶體(蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)http:∥www.rcsb.org/pdb；ID:3L8P)中提取出配體CEP112071的構(gòu)象，并以此構(gòu)象為模板構(gòu)建出共80個(gè)目標(biāo)分子(見(jiàn)表1，表2)。添加Gasterger-Hückel電荷，采用TRIPOS力場(chǎng)，以共軛梯度法優(yōu)化得到最低能量構(gòu)象，收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.001 kcal/(mol·A)。以此為起始構(gòu)象，用SYBYL-7.3中進(jìn)行分子對(duì)接研究[12,15]。

圖1 CEP112071化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 分子對(duì)接

用于分子對(duì)接計(jì)算的VEGFR2和Tie-2蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(VEGFR2：1YWN， Tie-2：3L8P)。對(duì)接前除去晶體結(jié)構(gòu)中與受體結(jié)合的原配體分子和水分子，并對(duì)受體蛋白進(jìn)行加氫并優(yōu)化，后在配體引導(dǎo)下生成protomol原型分子。分子表面的產(chǎn)生用molcad模塊。如無(wú)特別說(shuō)明，所有參數(shù)均采用SYBYL-7.3默認(rèn)值。Surflex-Dock打分函數(shù)以-log10為單位模擬結(jié)合能力，得分最高的構(gòu)象被認(rèn)為是最佳構(gòu)象[16]。

表1 1～17號(hào)雙效抑制劑的分子結(jié)構(gòu)與其生物活性[6-8,10]

表2 18～80號(hào)雙效抑制劑的分子結(jié)構(gòu)與其生物活性[9]

Table 2 Molecular structure of dual inhibitors No.18～80 and their biological activities[9]

NoR1R2pIC50/(nmol·L-1)Tie-2VEGFR218NH2CH2CH(CH3)27．327．9619NH2CH2CH2CH2CH36．647．06204-OMe-phenylNHCONHCH2CH38．407．96214-OMe-phenylNHCONHCH2CH2CH38．707．80224-OMe-phenylNHCONHCH2CH(CH3)28．527．74234-OMe-phenylNHCONHCH2CH2CH2CH38．157．00244-SMe-phenylNHCONHCH2CH2CH38．527．85254-NMe2-phenylNHCONHCH2CH2CH38．227．62264-Me-phenylNHCONHCH2CH2CH38．528．10272-F-5-Me-phenylNHCONHCH2CH2CH39．007．54282-F-5-CF3-phenylNHCONHCH2CH2CH38．406．8029PhenylNHCONHCH2CH2CH38．307．8030Phenyl(Me)NCONHCH2CH2CH38．708．15313-OMe-phenylNHCONHCH2CH(CH3)28．407．60322-OMe-phenylNHCONHCH2CH(CH3)28．107．39334-F-phenylNHCONHCH2CH2CH38．707．92343-F-phenylNHCONHCH2CH2CH38．707．92352-F-phenylNHCONHCH2CH2CH38．708．05364-Cl-phenylNHCONHCH2CH2CH38．227．32372-Cl-phenylNHCONHCH2CH2CH38．528．05382-Br-phenylNHCONHCH2CH2CH38．408．00392-ThienylCONHCH37．928．40402-ThienylCONHCH2CH(CH3)28．008．15412-FuranylCONHCH2CH2CH37．548．52422-FuranylCONHCH2CH(CH3)27．708．30434-OMe-phenylOCONHCH2CH2CH38．307．92444-F-phenylOCONHCH2CH2CH37．967．3445i-PrOCONHCH2CH2CH37．968．3046EtOCONHCH2CH2CH37．748．7047PrOCONHCH2CH2CH38．158．5248HH5．877．8049Hn-Pr6．877．8050Hi-Bu6．437．7751Aci-Pr6．147．1252Aci-Bu7．087．68532-Thiophene-COH6．878．70542-Thiophene-COEt7．379．00552-Thiophene-COPr7．598．30562-Thiophene-COi-Pr7．627．82572-Thiophene-COi-Bu7．708．22583-Thiophene-COi-Bu7．207．89(續(xù)上表)NoR1R2pIC50/(nmol·L-1)Tie-2VEGFR2592-Furan-COi-Bu7．148．40603-Cl-Thiophene-2-COCH2CH(CH3)27．898．15613-Br-Thiophene-2-COCH2CH(CH3)27．827．60623-Me-Thiophene-2-COCH2CH(CH3)28．308．00634-Me-Thiophene-2-COCH2CH(CH3)27．377．96643-Furan-COi-Bu7．248．1065H7．368．3066c-Pentyl7．397．2667c-Hexyl6．997．36

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對(duì)接方法的確認(rèn)

為驗(yàn)證對(duì)接方法的可信度，對(duì)接前分別將3L8P和1YWN復(fù)合物中的配體從受體的活性口袋中取出，優(yōu)化后再對(duì)接回結(jié)合口袋。對(duì)接產(chǎn)生的構(gòu)象與復(fù)合物中的構(gòu)象十分接近，均方根位移(RMSD)分別為0.065 30和0.072 60 nm，低于實(shí)驗(yàn)的最小分辨率，說(shuō)明對(duì)接方法得到的結(jié)果是可靠的。

將小分子數(shù)據(jù)集分別與VEGFR2、Tie-2進(jìn)行對(duì)接，比較分子對(duì)接結(jié)果。研究表明，吲哚咔唑類分子對(duì)VEGFR2/Tie-2的雙效抑制作用主要源于相似的結(jié)合模式：配體在兩種受體結(jié)合位點(diǎn)處的活性口袋位置相似，且相似位置的氨基酸殘基提供了氫鍵的受體或供體，形成螯合氫鍵，部分關(guān)鍵性的氨基酸殘基表現(xiàn)出相似的靜電特征，故吲哚咔唑類分子與兩類受體均有良好的結(jié)合活性，表現(xiàn)出雙效抑制劑的特征。然而，由于活性口袋的形狀大小有所差異，分子間的相互作用力不同，配體分子在兩類受體間的活性仍有差異，具體體現(xiàn)在下述幾個(gè)方面。

2.2 疏水作用分析

相關(guān)參考研究的計(jì)算表明，VEGFR2受體活性結(jié)合位點(diǎn)大體含有5個(gè)區(qū)域：①與絞鏈區(qū)相鄰的疏水殘基Val846,Ala864,Val897,Val914,Phe916,Leu1033組成的一個(gè)扁平的區(qū)域?yàn)槭杷虎瘢撌杷灰彩茿TP的腺嘌呤環(huán)的結(jié)合位點(diǎn),因此是抑制劑結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。②由疏水殘基Ile886,Leu887,Ile890,Val896,Val897,Leu1017,Ile1042組成疏水腔Ⅱ；疏水腔Ⅰ和Ⅱ之間有1個(gè)由Lys866,Glu883的側(cè)鏈和Asp1044骨架上的羰基氧共同形成的環(huán)形的小極性區(qū)域。③脂肪族疏水基團(tuán)(異丁烷、環(huán)乙烷)在活性腔開(kāi)口向溶劑處的Leu838和Phe916的側(cè)鏈附近也有分布。④在Arg1030殘基附近由Leu1033和Cys1043組成的疏水區(qū)域Ⅳ。另外,苯環(huán)在Arg1030的胍基附近也有分布,形成陽(yáng)離子-π相互作用[17-18]。

對(duì)Tie-2的受體活性口袋進(jìn)行分析，根據(jù)其疏水性質(zhì)將其中關(guān)鍵區(qū)域劃分為兩個(gè)區(qū)域：Ⅰ區(qū)由疏水殘基Ile830,Val838,Ala853,Ile886,Leu971構(gòu)成狹窄扁平的輸水腔，Ⅱ 區(qū)由Val875,Leu876,Leu888,Leu900,Ile902,Phe983構(gòu)成另一空間較小半封閉區(qū)域，Asp982的極性親水殘基在這里起到了隔斷兩個(gè)疏水腔的作用。

圖2 結(jié)合位點(diǎn)疏水腔的劃分以及疏水性質(zhì)的差異

從活性位點(diǎn)親水性和疏水性表面的分布(圖2)發(fā)現(xiàn)，二羥吲哚咔唑分子母核均與活性腔Ⅰ區(qū)結(jié)合，3號(hào)C原子側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)均結(jié)合于疏水腔Ⅱ。不同的是Tie-2的Ⅱ區(qū)域空間更小，疏水作用對(duì)整體活性影響更大，例如11號(hào)和12號(hào)分子僅在3號(hào)C原子側(cè)鏈的頂端有微小不同，兩者Tie-2活性相似而VEGFR2活性則差異較大。Tie-2沒(méi)有對(duì)應(yīng)于Ⅲ區(qū)的疏水區(qū)域，故對(duì)于配體分子13號(hào)N原子連接側(cè)鏈區(qū)域的選擇性較弱，對(duì)接中我們發(fā)現(xiàn)16號(hào)分子和17號(hào)分子在該區(qū)域分別為異丙基和乙基，兩者的Tie-2活性相似而VEGFR2活性有所差異，說(shuō)明此處是VEGFR2的關(guān)鍵選擇性位點(diǎn)，Tie-2則不然。配體分子F環(huán)顯親水性，與Tie-2開(kāi)口向溶劑處Gly908親水區(qū)域結(jié)合，提高與Tie-2的結(jié)合親和力，我們推測(cè)在這里引入側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)，如烴基、烯烴基等，有助于提高配體的VEGFR2活性，而保留或加強(qiáng)親水性基團(tuán)、將雜氮環(huán)改為芳環(huán)，則有利于提高與Tie-2的結(jié)合活性。

2.3 靜電作用分析

靜電作用方面，配體分子側(cè)鏈酰胺鍵兩個(gè)N原子側(cè)翼呈正電性、O呈負(fù)電性，與VEGFR2的對(duì)接中和Glu883間存在較強(qiáng)吸引，同時(shí)吸引突出于受體表面的Asp1044彎向Lys866，形成鰲狀鉗住配體分子；類似的，與Tie-2的對(duì)接中與Lys855形成吸引，誘使Lys855突出表面彎向負(fù)電性的Asp982，嵌住配體分子。兩者不同之處在于：A環(huán)上顯負(fù)電的雜氮原子以及以碳氧雙鍵結(jié)合于環(huán)上的氧原子，可與VEGFR2的Phe916、Cys917互相吸引，有利于配體分子在VEGFR2活性口袋中相對(duì)位置的固定； F環(huán)上呈強(qiáng)負(fù)電性的雜氮原子，可與VEGFR2的Leu838相吸引，同時(shí)吸引Glu920的突出部分彎向Leu838，同樣對(duì)配體分子起到固定作用。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)13號(hào)N原子連接的側(cè)鏈與VEGFR2對(duì)接時(shí)處于正電性的Glu839、Arg840附近，在與Tie-2對(duì)接時(shí)則靠近具有負(fù)電性質(zhì)的Glu832。如果我們?cè)谠搮^(qū)域引入具有強(qiáng)電荷性質(zhì)的基團(tuán)，可能收獲較理想的選擇性(圖3)。

圖3 結(jié)合位點(diǎn)表面靜電性質(zhì)的差異

2.4 氫鍵分析

圖4 VEGFR2/Tie-2與配體的結(jié)合模式

兩者不同處在于3號(hào)C原子側(cè)鏈附近，VEGFR2上Asp1044僅提供氫鍵供體，相應(yīng)位置Tie-2的Phe983和Asp982則可分別提供潛在供、受體。在受體另一側(cè)，Glu883和Lys866分別提供氫鍵受體和供體，而Tie-2相應(yīng)位置則只有Lys855能提供氨基作為氫鍵供體。此處氫鍵供受體構(gòu)象的翻轉(zhuǎn)使得配體分子在結(jié)合時(shí)結(jié)合構(gòu)象不同，對(duì)結(jié)合活性產(chǎn)生了影響。

2.5 空間位阻分析

在以上的對(duì)接分析中我們還發(fā)現(xiàn)，VEGFR2的活性位點(diǎn)較Tie-2的更為開(kāi)放，未完全地包裹配體分子，使得由疏水力、靜電作用和氫鍵作用帶來(lái)的影響遠(yuǎn)不及Tie-2明顯，例如23號(hào)分子在3號(hào)C原子側(cè)鏈的頂端連有一個(gè)甲氧基，表現(xiàn)出良好的Tie-2活性，但對(duì)VEGFR2的活性較差。同時(shí)，更加開(kāi)放的活性口袋也為配體分子的側(cè)鏈伸展提供了可能性。如果我們?cè)诟鱾€(gè)側(cè)鏈上引入體積較大的基團(tuán)，或是延長(zhǎng)側(cè)鏈，則可能降低候選分子與Tie-2的結(jié)合活性，達(dá)到特異性選擇的目的。

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)分子對(duì)接的方法對(duì)吲哚咔唑系列分子和VEGFR2/Tie-2的相互作用做了研究，分析了該系列分子與受體結(jié)合的最佳結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和結(jié)合機(jī)制，分子對(duì)接模擬得到的結(jié)果與所揭示的機(jī)制與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相吻合。研究表明，抑制劑分子主要通過(guò)疏水作用、氫鍵和靜電作用嵌合在激酶受體的活性位點(diǎn)中，使其催化活性受到抑制，干擾血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)，從而對(duì)腫瘤的產(chǎn)生起到干預(yù)作用。其中，兩類受體間表面疏水腔性質(zhì)的不同是影響配體選擇性的主要原因。本研究對(duì)闡明該系列分子的抗腫瘤機(jī)制具有理論指導(dǎo)作用，進(jìn)而為藥物分子設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

本研究的結(jié)果說(shuō)明，不同激酶受體之間可能存在著相同或者相似的結(jié)構(gòu)區(qū)域，與特定配體的結(jié)合特性相近，可以通過(guò)一系列配體化合物達(dá)到抑制多個(gè)靶點(diǎn)的效果。分析不同激酶受體在結(jié)合模式上的不同有助于設(shè)計(jì)具有高效選擇性的抑制劑藥物，在保證藥效的情況下提高藥物的針對(duì)性降低毒副作用，使設(shè)計(jì)藥物具有臨床實(shí)用的可能。

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