元英進(jìn)，秦 磊，李炳志，艾瑞婷

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2. 中國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心，北京 100036)

用秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)纖維素乙醇以取代化石能源的使用，一方面可以減少二氧化碳的排放，另一方面可以減少石油等化石能源的消耗．如何提高從農(nóng)業(yè)廢棄物到乙醇的轉(zhuǎn)化效率并且降低成本，是制約纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素[1-4]．纖維素乙醇上游工藝包括原料預(yù)處理、酶解糖化和發(fā)酵等環(huán)節(jié)．預(yù)處理過(guò)程在纖維素乙醇生產(chǎn)的上游過(guò)程中占大部分成本，并且對(duì)乙醇產(chǎn)率有至關(guān)重要的作用[5]．預(yù)處理使木質(zhì)纖維素在常溫或高溫下與催化劑反應(yīng)，使纖維素、半纖維素與木質(zhì)素等木質(zhì)纖維素原料的復(fù)雜結(jié)構(gòu)能夠得到分解，使纖維素酶更容易與纖維素接觸．預(yù)處理方法主要包括稀酸預(yù)處理、氨水預(yù)處理、氫氧化鈣預(yù)處理、高壓熱水預(yù)處理、氨爆破預(yù)處理、蒸汽爆破預(yù)處理和有機(jī)溶劑預(yù)處理等[1-3,6-12]．有機(jī)溶劑預(yù)處理是一種針對(duì)木質(zhì)素含量較高的木本類原料的有效預(yù)處理方法，采用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、過(guò)乙酸和丙酮等，有機(jī)溶劑預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)是可以有效去除木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素，并且有機(jī)溶劑可以通過(guò)減壓蒸餾等方法回收．在有機(jī)溶劑中加入硫酸、磷酸等催化劑可以提高木質(zhì)素的去除率[10-12]．在酸堿催化的預(yù)處理過(guò)程中，木質(zhì)纖維素原料由于過(guò)度水解會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，其中，五碳糖和六碳糖降解產(chǎn)生呋喃類和羧酸類化合物，木質(zhì)素降解成芳香類化合物[13-14]．預(yù)處理方法的優(yōu)劣不僅要通過(guò)酶解效率來(lái)評(píng)價(jià)，還要考慮產(chǎn)生的抑制物對(duì)酶解和發(fā)酵的影響．利用高效液相色譜和質(zhì)譜等方法全面準(zhǔn)確地測(cè)定降解產(chǎn)物的種類和含量已經(jīng)是評(píng)價(jià)預(yù)處理的重要指標(biāo)[15-18]．

常用預(yù)處理方法往往需要較高的溫度(160～220,℃)有效地破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，這就要求高成本的設(shè)備和較高的能量進(jìn)行反應(yīng)，并且產(chǎn)生的抑制物明顯增加．如何通過(guò)中低溫度下的預(yù)處理達(dá)到較高的酶解效率是需要解決的問(wèn)題．

水稻是我國(guó)的主要糧食作物，產(chǎn)生的水稻秸稈數(shù)量巨大．筆者以水稻秸稈為原料，研究了乙醇預(yù)處理中酸濃度和乙醇溶劑對(duì)纖維素酶解的影響．另外，利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同條件下的木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物進(jìn)行了半定量分析和比較．

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材 料

水稻秸稈取自天津市北辰區(qū)，自然風(fēng)干后粉碎過(guò)篩，取 20～80目的部分．材料的成分按美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)的實(shí)驗(yàn)分析規(guī)范(LAP)[19]操作．原料的成分分析結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 水稻秸稈成分Tab.1 Composition of rice straw %

1.2 預(yù)處理和酶解

原料的預(yù)處理和酶解流程見(jiàn)圖1．

圖1 水稻秸稈預(yù)處理和酶解流程Fig.1 Pretreatment and enzymatic hydrolysis process of rice straw

預(yù)處理是將反應(yīng)體系裝入 1,L帶密封蓋的玻璃容器中，放入立式壓力蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行反應(yīng)．表 2列出了預(yù)處理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中不同組別的酸濃度和乙醇濃度，其他固定反應(yīng)條件為固液比 1∶10(質(zhì)量比)，反應(yīng)溫度120,℃，反應(yīng)時(shí)間60,min．

表2 預(yù)處理反應(yīng)條件Tab.2 Pretreatment condition %

預(yù)處理后的固液混合物用紗布過(guò)濾，并用約2.5,L蒸餾水沖洗固體，至洗液呈中性．固體在 55,℃下烘干，干燥后按LAP方法分析成分，用于酶解．

預(yù)處理得到的液體部分用Ca(OH)2中和至pH＝6.0，11,000,r/min離心15,min，收集上清液．含有乙醇的上清液在 45,℃、5,kPa下蒸干，再加水定容至100,mL．經(jīng)上述處理得到的溶液用 0.22,μm 濾膜過(guò)濾，用 Aminex HPX-87H(Bio-Rad)色譜柱耦合示差檢測(cè)器(Waters 2414)測(cè)量葡萄糖和木糖濃度，流動(dòng)相為 5,mmol H2SO4，流速 0.6,mL/min，柱溫 60,℃．

酶解在 500,mL錐形瓶中進(jìn)行，反應(yīng)體積為125,mL，葡聚糖負(fù)荷為 6%．葡聚糖負(fù)荷定義為葡聚糖的質(zhì)量在總固液混合物體積中的百分?jǐn)?shù)(認(rèn)為水稻秸稈的密度是 1,g/mL)，使用相同的葡聚糖負(fù)荷即控制相同的底物濃度．纖維素酶Spezyme CP(Genecor，酶活為 33,FPU/mL)和纖維二糖酶 Novozyme 188(Sigma，酶活為 870,CBU/mL)分別按終濃度為15,FPU/g葡聚糖和 30,CBU/g葡聚糖加入酶解體系中．分別加入鹽酸四環(huán)素、檸檬酸鈉緩沖液和蒸餾水，使鹽酸四環(huán)素和檸檬酸鈉的最終濃度分別為40,mg/L和 50,mmol/L．酶解條件為 50,℃、250,r/min.反應(yīng) 72,h后，固液混合物在 11,000,r/min下離心15,min，測(cè)量酶解液的體積和糖濃度．用蒸餾水洗滌固體殘?jiān)㈦x心，測(cè)量洗液的體積和糖濃度，這一過(guò)程用來(lái)計(jì)算葡萄糖和木糖的轉(zhuǎn)化率，即

式中：V1和 V2分別為酶解液和洗液的體積，mL；cg1、cx1、cg2、cx2分別為酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度、木糖質(zhì)量濃度、洗液中葡萄糖質(zhì)量濃度、木糖質(zhì)量濃度，g/mL；mg和 mx分別為酶解初始條件下葡聚糖和木聚糖質(zhì)量，g．

1.3 預(yù)處理液體部分中降解產(chǎn)物的測(cè)定

預(yù)處理液體樣品經(jīng) 0.22,μm濾膜過(guò)濾后，用濃硫酸將 pH調(diào)節(jié)至 1.0～2.0．取 3,mL樣品放入 10,mL離心管中，加入 1,mL內(nèi)標(biāo)溶液(0.04,mg/mL氘標(biāo)記琥珀酸，溶劑為甲醇)并混合均勻．加入 2,mL 甲基叔丁基醚(MTBE)進(jìn)行萃取，在搖床混合 30,min后4,500,r/min離心 3,min，取上層萃取液．每個(gè)樣品萃取 3次．收集 3次的萃取液并在 55,℃下吹干，加入1,mL MTBE將固體溶解，用 0.22,μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)溶液．

氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)測(cè)量降解產(chǎn)物：GC-MS系統(tǒng)包括自動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent 7683)，氣相色譜(Agilent 6869)，TOF質(zhì)譜(Waters)和色譜柱(30,m×0.25,mm，DB-5MS)．1,μL 樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入氣相色譜，進(jìn)樣口段溫度為 280,℃，高純氦氣作為載氣，載氣壓力恒定在 91,kPa．柱箱的溫度程序設(shè)為：進(jìn)樣后爐溫在 50,℃保持 2,min，以 8,℃/min的速度升溫到 290,℃，保持 3,min，再降溫到 50,℃．流出色譜柱的物質(zhì)進(jìn)入溫度為250,℃的離子源，離子化方式為 EI+，離子束電壓為 70,eV，離子電流為 40,μA，在荷質(zhì)比50～800范圍掃描，分流比為3∶1．

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Masslynx軟件對(duì) GC-MS測(cè)定的降解產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行定性和定量分析．

使用MATLAB軟件對(duì)降解產(chǎn)物的定量結(jié)果進(jìn)行主成分分析，在第1主成分和第2主成分上繪制成得分圖和載荷圖．在主成分分析的過(guò)程中，樣品的 3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)都作為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，而不是取均值代之．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)預(yù)處理固體部分和液體部分的影響

圖 2為不同預(yù)處理?xiàng)l件下預(yù)處理固體部分的回收率以及葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素的回收率，回收率定義為預(yù)處理后的質(zhì)量占預(yù)處理前的質(zhì)量分?jǐn)?shù). 在1～3組實(shí)驗(yàn)中不加乙醇，即為常規(guī)稀酸預(yù)處理，在4～6組實(shí)驗(yàn)中加入乙醇，即乙醇預(yù)處理，因此乙醇預(yù)處理可看作是對(duì)稀酸預(yù)處理的一種改進(jìn)．其中，預(yù)處理固體部分的回收率隨酸濃度的升高而降低．固體中葡聚糖的回收率受乙醇和酸濃度的影響非常小，隨酸濃度的升高略有下降．木聚糖回收率受酸濃度的影響顯著，隨酸濃度的升高明顯降低．固體中木質(zhì)素的回收率在稀酸預(yù)處理中基本不受酸濃度影響，而在乙醇預(yù)處理中木質(zhì)素回收率受酸濃度升高而明顯降低．可以看出，木質(zhì)素的去除需要 2方面的條件：一方面木質(zhì)素需要通過(guò)酸的催化發(fā)生化合鍵的斷裂，這一反應(yīng)與氫離子濃度呈正相關(guān)；另一方面，在稀酸預(yù)處理后，木質(zhì)素會(huì)經(jīng)過(guò)高溫在纖維素表面重新排列形成顆粒狀沉積物[20]，而乙醇的加入可以有效地溶解木質(zhì)素片段．

圖2 預(yù)處理固體部分以及固體中葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素的回收率Fig.2 Recovery of solid fraction，glucan，xylan and lignin in pretreatment

圖 3為稀酸預(yù)處理和乙醇預(yù)處理中木糖守恒隨酸濃度的變化情況．由于葡聚糖在固體和液體部分的回收率相加基本為 100%(圖中沒(méi)有顯示)，說(shuō)明在預(yù)處理中葡萄糖基本沒(méi)有發(fā)生降解．而木聚糖在固體部分和液體部分的回收率相加不到 100%．在稀酸預(yù)處理中，降解的木糖占總量的 10%左右，基本不隨酸濃度的變化改變；在乙醇預(yù)處理中，降解的木糖比例隨酸濃度升高而升高，分別為 30.8%、59.7%和64.7%．在預(yù)處理后固體中木聚糖降解為木糖，溶液中的木糖又降解為其他小分子物質(zhì)，這2步降解在乙醇預(yù)處理中均隨酸濃度升高而加?。?/p>

圖3 預(yù)處理中木糖守恒隨酸濃度的變化Fig.3 Xylose balance variations in pretreatments with different acid concentrations

2.2 不同預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)酶解的影響

在葡聚糖負(fù)荷 6%、纖維素酶和纖維二糖酶量分別為15,FPU/g葡聚糖和30,CBU/g葡聚糖的條件下，預(yù)處理后的固體部分酶解反應(yīng)72,h，得到酶解液中葡萄糖和木糖的濃度和轉(zhuǎn)化率見(jiàn)圖 4．葡萄糖濃度和轉(zhuǎn)化率在不同酸濃度的稀酸預(yù)處理中差別不明顯，木糖的濃度有一定差別，這與酶解前固體中木聚糖負(fù)荷有關(guān)．在乙醇預(yù)處理中，葡萄糖濃度及轉(zhuǎn)化率隨酸濃度的升高而明顯提高．2%酸濃度的乙醇預(yù)處理葡萄糖濃度和轉(zhuǎn)化率分別為 53.9,g/L和 71.5%，比 2%酸濃度的稀酸預(yù)處理分別提高了12.0,g/L和17.0%．

表3列出了酶解初始條件下木聚糖、木質(zhì)素和其他成分(灰分、蛋白質(zhì)和萃取物等)的負(fù)荷，這 3個(gè)因素分別與 72,h酶解后葡萄糖轉(zhuǎn)化率無(wú)確定的關(guān)系．但木聚糖、木質(zhì)素和其他成分的負(fù)荷總和與葡萄糖轉(zhuǎn)化率呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系(圖 5，R2＝0.929)．因此，影響酶解轉(zhuǎn)化率的不是單一成分的因素，在相同葡聚糖負(fù)荷和酶用量下，葡聚糖以外成分的負(fù)荷的增加都會(huì)抑制酶解的轉(zhuǎn)化率．這提供了一種簡(jiǎn)便的預(yù)測(cè)酶解轉(zhuǎn)化率的方法．

2.3 預(yù)處理液體部分中降解產(chǎn)物的分析

表 4列出了利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定預(yù)處理液體中降解產(chǎn)物的名稱和保留時(shí)間，不同預(yù)處理?xiàng)l件下的降解產(chǎn)物在種類上沒(méi)有差別，共鑒別出 33種物質(zhì)，分為 3類：呋喃類 4種，羧酸類 3種，芳香類 26種．另外有未知物7種．由于氣相質(zhì)譜的檢測(cè)范圍偏向于大分子物質(zhì)，因此可能存在的甲酸、乙酸等小分子物質(zhì)無(wú)法檢測(cè)到．

圖4 預(yù)處理固體酶解后糖濃度和糖轉(zhuǎn)化率Fig.4 Concentration and yield of glucose and xylose in enzymatic hydrolysis

表3 酶解初始條件下木聚糖、木質(zhì)素與其他成分的負(fù)荷與72 h酶解后葡萄糖轉(zhuǎn)化率Tab.3 Loadings of xylan，lignin and others at initial enzymatic condition and glucose conversion after 72 h enzymatic hydrolysis %

圖5 酶解初始條件下木聚糖、木質(zhì)素與其他成分的總負(fù)荷與72 h酶解后葡萄糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系Fig.5 Relationship between the loadings of xylan，lignin and others at initial enzymatic hydrolysis and glucose conversion after 72 h enzymatic hydrolysis

表4 氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定預(yù)處理液體中的降解產(chǎn)物Tab.4 Degradation products determined by GC-MS in liquid from pretreatment

通過(guò) Masslynx軟件對(duì)測(cè)定的物質(zhì)進(jìn)行定量，可得到40種物質(zhì)在6種條件下的相對(duì)含量．利用主成分分析這一數(shù)學(xué)方法可判斷 6種條件下樣品中降解產(chǎn)物含量的整體差別(聚類得分圖見(jiàn)圖 6)和 40種降解產(chǎn)物在不同條件下的差別(載荷圖見(jiàn)圖7)．

主成分分析的聚類得分圖(圖 6)中每點(diǎn)代表一個(gè)樣品，各點(diǎn)的距離表示每個(gè)樣品中所有成分的量的整體差別，距離越近表示整體差別越小，可以歸為一類．組1和組4成分含量相近，組2和組3成分含量相近，組5和組6成分含量相近，說(shuō)明在0.5%酸濃度下，乙醇對(duì)木質(zhì)素等物質(zhì)的降解影響很??；而在 1%和2%酸濃度下乙醇是木質(zhì)素降解的主要影響因素．

圖6 不同預(yù)處理液體部分中降解產(chǎn)物的主成分分析得分圖Fig.6 Score plot of principle component analysis of degradation products in liquids from pretreatment

主成分分析的載荷圖(圖 7)中每點(diǎn)代表一種物質(zhì)，每點(diǎn)距中心原點(diǎn)的距離可以判斷每點(diǎn)在各樣品間的差別．各點(diǎn)距原點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)，表示此成分的含量在各組間的差別越大，即可認(rèn)為這種物質(zhì)為表征組間差別的標(biāo)志物，圖 7中的標(biāo)志物可歸納為：糠醛、對(duì)甲基苯甲醛、羥甲基糠醛、對(duì)乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛、高香草酸甲酯、對(duì)香豆酸、阿魏酸．其中，糠醛、羥甲基糠醛和高香草酸甲酯3種物質(zhì)在1～3組中含量較高，其他 5種物質(zhì)在乙醇預(yù)處理液中濃度較高．由于乙醇預(yù)處理的液體經(jīng)過(guò)減壓蒸餾去除乙醇，同時(shí)也去除了易揮發(fā)的糠醛和羥甲基糠醛，因此這兩種物質(zhì)在4～6組中含量很低．其他6種物質(zhì)均為木質(zhì)素降解產(chǎn)生的芳香類化合物，是區(qū)別預(yù)處理?xiàng)l件的標(biāo)志物．

圖7 不同預(yù)處理液體部分中降解產(chǎn)物的主成分分析載荷圖Fig.7 Loading plot of principle component analysis of degradation products in liquids from pretreatment

3 結(jié) 論

(1) 硫酸濃度 2%、乙醇濃度 50%、120,℃、60,min預(yù)處理?xiàng)l件是稻草秸稈的最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件；在葡聚糖負(fù)荷 6%、纖維素酶和纖維二糖酶用量分別為 15,FPU/g葡聚糖和 30,CBU/g葡聚糖、酶解 72,h的條件下，固體酶解液中葡萄糖濃度和轉(zhuǎn)化率分別可達(dá)53.9,g/L和71.5%，明顯高于其他預(yù)處理?xiàng)l件．

(2) 酶解液葡萄糖轉(zhuǎn)化率與酶解初始條件下木聚糖、木質(zhì)素和其他成分的總負(fù)荷呈近似線性關(guān)系，這一點(diǎn)可以幫助預(yù)測(cè)酶解轉(zhuǎn)化率．

(3) 通過(guò)主成分分析對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行歸類，并得到區(qū)別這些預(yù)處理?xiàng)l件的6種主要標(biāo)志物．

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