唐曉勇，唐迎雪

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355;2山東省腫瘤醫(yī)院)

目前，干預(yù)和克服多藥耐藥是提高肺癌療效的重要手段。浙貝母堿是中藥浙貝母的主要成分，近年來(lái)其抗腫瘤作用逐漸得到廣泛認(rèn)同。人肺耐藥蛋白(LRP)被認(rèn)為與順鉑(DDP)原發(fā)耐藥關(guān)系密切。2010年3月～2011年6月，我們觀察了浙貝母堿對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。浙貝母堿(貝母素甲)，順鉑，RPMI-1640培養(yǎng)基和12%小牛血清，MTT，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，鼠抗人LRP單克隆抗體。EL340i酶標(biāo)儀，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀，LSM510型激光共聚焦顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549/DDP細(xì)胞用12%胎牛血清培養(yǎng)，用2μg/mL的DDP維持其耐藥性;在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)前2周將A549/DDP細(xì)胞換用無(wú)DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響及其逆轉(zhuǎn)耐藥最佳濃度的確定 采用MTT法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP，用胰蛋白酶、EDTA消化后計(jì)數(shù);用含12%胎牛血清在RPMI-1640培養(yǎng)基配成一定濃度，以5×103/孔接種96孔板;細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、800μg/mL的浙貝母堿，置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);對(duì)照組加相同濃度的藥物溶解介質(zhì)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入20μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后以1 000 r/min離心3 min，棄上清;每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔吸光值(A值)，參比波長(zhǎng)為630 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。根據(jù)文獻(xiàn)，確定細(xì)胞增殖抑制率≤5%的藥物濃度為該藥的非細(xì)胞毒性濃度，并作為最佳逆轉(zhuǎn)耐藥濃度。

1.2.3 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用的觀察 采用 MTT法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP，消化、接種同 1.2.2。對(duì)照組分別加入終質(zhì)量濃度為 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL的DDP，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上再加入逆轉(zhuǎn)濃度的浙貝母堿。全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔A值，參比波長(zhǎng)為630 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。采用直線回歸方程計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率50%時(shí)的DDP濃度，即為半數(shù)抑制濃度(IC50)。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=對(duì)照組IC50/實(shí)驗(yàn)組IC50。

1.2.4 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡影響的觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP，分為3組?？瞻讓?duì)照組不加任何藥物，對(duì)照組加入DDP(終質(zhì)量濃度為4μg/mL)，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上再加入逆轉(zhuǎn)濃度的浙貝母堿。藥物作用48 h后，吹打成細(xì)胞懸液;以2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞;用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集2×105個(gè)細(xì)胞，加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5μL Annexin V-FITC混勻后，再加入20μL Propidium Iodide混勻;室溫避光，反應(yīng)5～15 min;加入250μL Binding Buffer到樣品中，混勻后300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾;在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的上機(jī)觀察和檢測(cè)分析，激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為530 nm。

1.2.5 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞中LRP蛋白表達(dá)影響的觀察 采用細(xì)胞免疫熒光法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分組及處理同1.2.4。培養(yǎng)48 h后取出蓋玻片，以PBS液漂洗3次;按試劑盒說(shuō)明操作，熒光顯微鏡下觀察。LRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。高倍鏡下(×200)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值，表示LRP蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖的影響及其逆轉(zhuǎn)耐藥的最佳濃度 50、100、200、400、800 μg/mL的浙貝母堿作用48 h，A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率分別為 2.31% ± 0.25%、2.58% ± 0.17%、3.62% ±1.12%、4.54% ±0.86%、9.33% ±0.22%，浙貝母堿逆轉(zhuǎn)耐藥的最佳濃度為400μg/mL。

2.2 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用各組隨DDP濃度的增加，浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率不斷增加(P均＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組DDP 的 IC50為4.15 μg/mL，對(duì)照組為15.46 μg/mL，浙貝母堿的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為3.73。見(jiàn)表1。

表1 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2.3 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響 培養(yǎng)48 h后，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為2.56% ±0.44%，對(duì)照組為 13.5% ± 1.42%，實(shí)驗(yàn)組為38.16% ±2.25%;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，P均＜0.05。

2.4 浙貝母堿對(duì)A549/DDP細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)48 h后，空白對(duì)照組LRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為(9.8 ±1.92)個(gè)/HP，對(duì)照組為(9.2 ±1.9)個(gè)/HP，實(shí)驗(yàn)組為(5.8 ±1.3)個(gè)/HP;實(shí)驗(yàn)組 LRP 蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，P均＜0.05。

3 討論

腫瘤多藥耐藥的可能機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低、藥物解毒系統(tǒng)活性增強(qiáng)［1］、DNA修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)［2，3］、藥物誘導(dǎo)凋亡的變更［4，5］等。其中 LRP 介導(dǎo)的藥物外排機(jī)制是DDP耐藥的重要原因。LRP與P-gp、MRP不同，不屬于ABC超家族成員，也沒(méi)有與ATP結(jié)合的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域。LRP主要分布于細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞膜，是構(gòu)成人體穹窿蛋白的主要成分，廣泛分布在人體與外界相通的體腔上皮、血腦屏障、巨噬細(xì)胞和分泌性器官中，被認(rèn)為與機(jī)體清除有害物質(zhì)有關(guān)。研究［6］證實(shí)，LRP與鉑類藥物的原發(fā)性耐藥關(guān)系密切。LRP誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞多藥DDP耐藥的機(jī)理包括:①阻止DDP進(jìn)入細(xì)胞核，或者將己進(jìn)入核內(nèi)的藥物通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)載體泵至核外;②將胞質(zhì)中的DDP轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡，使藥物呈房室性分布，通過(guò)胞吐機(jī)制將藥物排至細(xì)胞外。

耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要從應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)(如小干擾RNA沉默耐藥相關(guān)基因［7］)和化學(xué)合成藥物(如托瑞米芬［8］、環(huán)孢菌素［9］、維拉帕米［10］等)方面展開(kāi)，多因技術(shù)繁瑣或不良反應(yīng)大而未廣泛應(yīng)用于臨床。浙貝母是臨床上常用化痰藥物，其藥理作用包括鎮(zhèn)咳化痰、松弛支氣管平滑肌［11］，鎮(zhèn)痛、抗炎［12］，降壓、活血化瘀，抗?jié)兗澳孓D(zhuǎn)細(xì)菌耐藥［13］等作用。作為浙貝母的主要成分，浙貝母堿的抗腫瘤作用越來(lái)越得到廣泛認(rèn)同，尤其是在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面具有廣泛的研究前景，有望成為有效的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。胡凱文等［14］應(yīng)用浙貝母堿逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象，MTT顯示浙貝母堿對(duì)阿霉素殺傷多藥耐藥K562/A02、HL-60/Adr細(xì)胞株具有明顯的增敏作用，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)約為5。流式細(xì)胞儀顯示，浙貝母堿通過(guò)抑制耐藥細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)，從而增加了DNR在耐藥白血病細(xì)胞內(nèi)的蓄積，逆轉(zhuǎn)了部分細(xì)胞的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，浙貝母堿逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)3.73。與空白對(duì)照組、對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率增高，表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)。因此，浙貝母堿可逆轉(zhuǎn)肺癌A549/DDP細(xì)胞株的多藥耐藥，其機(jī)理與促進(jìn)細(xì)胞凋亡、下調(diào)L-RP蛋白表達(dá)介導(dǎo)藥物重新分布有關(guān)。

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