楊政興， 嚴(yán) 偉， 陳忠銘， 劉美寶， 李 炤

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的28.7%，約30%的腎癌患者首次就診時(shí)即已屬晚期［1］。美國轉(zhuǎn)移性腎癌患者的2年生存率在0～20%之間波動(dòng)［2］。腎癌具有多藥物耐藥基因，對化學(xué)治療及放療不敏感。非特異性免疫治療白細(xì)胞介素-2(IL-2)或干擾素-α(IFN-α)聯(lián)合應(yīng)用雖被公認(rèn)是腎癌的第一線治療方案，但只有少數(shù)患者受益，顯然急需新的治療策略［3］。索拉非尼(sorafenib)是一種新型靶向抗腎癌藥物，2008年NCCN腫瘤治療指南已經(jīng)將sorafenib應(yīng)用于晚期腎癌的一線治療。目前sorafenib與其他靶向治療藥物、細(xì)胞因子、化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療晚期腎癌的多個(gè)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行或即將開始，部分試驗(yàn)已初步顯示出其療效顯著。本文通過研究sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清IL-2及TNF-α水平的影響，進(jìn)一步探討sorafenib與細(xì)胞因子之間的關(guān)系，旨在為臨床聯(lián)合用藥，提高療效，擴(kuò)大適應(yīng)證范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及腎癌細(xì)胞株 BALB/c-nu/nu裸鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司提供(SPF級)，33只，4 周齡，體重(14.0 ±0.5)g，雌雄各半。OS-RC-2腎癌細(xì)胞株購于上海中科院。

1.2 主要試劑 sorafenib購于拜耳公司，200 mg/片;ELISA試劑盒(檢測IL-2及TNF-α水平)購于美國BMS公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司。

1.3 OS-RC-2腎癌細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞懸液制作OS-RC-2腎癌細(xì)胞株于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基、37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液傳代，每3天傳代1次。當(dāng)OS-RC-2腎癌細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，用 0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA消化液離心收集OS-RC-2細(xì)胞，PBS洗3次，用PBS重懸OS-RC-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/150μL。

1.4 裸鼠人腎癌模型的建立及鑒定 BALA/c-nu/nu裸鼠，用4%水合氯醛(0.1mL/10g)麻醉后，用帶25號針頭1 mL注射器分別吸取上述OS-RC-2細(xì)胞懸液150μL，注射于每只裸鼠于左前肢腋部皮下，共33只。1周后皮下瘤塊形成，隨機(jī)選取3只裸鼠，處死后取皮下瘤塊行病理檢查，確定OS-RC-2細(xì)胞瘤塊造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 選取經(jīng)鑒定合格裸鼠人腎癌模型(接種后1周)30只，隨機(jī)分3組:對照組、sorafenib低劑量組及sorafenib高劑量組各10只。對照組:1 mL PBS灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14天;sorafenib低劑量組:sorafenib按20 mg/kg劑量，溶于1 mL PBS灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃14天;sorafenib高劑量組:sorafenib按80 mg/kg劑量，溶于1mL PBS灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃14天。

1.6 IL-2及TNF-α測定 分別于給藥后第7天及14天，隨機(jī)選取對照組、低劑量組及高劑量組各5只，通過眼球摘除法采血，每只小鼠采血量約為0.5 mL，用ELISA法測定給藥后第7、14天各組血清中細(xì)胞因子IL-2和TNF-α水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用 LSD-t法檢驗(yàn)，α =0.05，以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后第7天sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的影響(表1) 由表1可見，sorafenib低劑量組及高劑量組血清中IL-2含量明顯低于對照組(P＜0.05);sorafenib高劑量組血清中TNF-α含量明顯低于對照組(P＜0.05)。

表1 給藥后第7天人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

表1 給藥后第7天人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

*:與對照組相比，P ＜0.05;△:與對照組相比，P ＜0.05。

組別 IL-2(ng/L) TNF-α(ng/L)對照組 1.77 ±0.36 1.34 ±0.21 sorafenib 低劑量組 1.38 ±0.16* 1.32 ±0.26 sorafenib高劑量組 1.34 ±0.30* 1.07 ±0.26△

2.2 給藥后第14天sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的影響(表2) 由表2可見，對照組、sorafenib低劑量組及高劑量組血清中IL-2含量兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);對照組、sorafenib低劑量組及高劑量組血清中TNF-α含量兩兩比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＞0.05)。

表2 給藥第14天后人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

表2 給藥第14天后人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

組別 IL-2(ng/L) TNF-α(ng/L)對照組 0.75 ±0.09 0.75 ±0.20 sorafenib 低劑量組 0.71 ±0.06 0.65 ±0.04 sorafenib高劑量組0.79 ±0.15 0.61 ±0.12

3 討論

根治性腎切除術(shù)為腎癌目前首選的治療方法，但術(shù)后及轉(zhuǎn)移性腎癌目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的輔助治療方案。由于腎癌對放化療均不敏感，所以免疫治療就成為目前臨床上治療晚期轉(zhuǎn)移性腎癌的主要治療手段。然而研究表明，只有約15%的患者對細(xì)胞因子IL-2和IFN-α的免疫治療敏感，而其他大部分患者不敏感，效果不理想［4］。有學(xué)者進(jìn)行了局限性晚期腎細(xì)胞癌行全腎切除后是否應(yīng)用IFN-α及IL-2治療的隨機(jī)對照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后細(xì)胞因子的輔助治療在延緩復(fù)發(fā)時(shí)間和延長患者生存期上并沒有明顯優(yōu)勢［5-6］。

索拉非尼(sorafenib)是一種新型抗腎細(xì)胞癌的分子靶向藥物，其為多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，能通過抑制RAF-MEK-ERK信號傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長，還能通過抑制VEGF、PDGF及EGF等生長因子的表達(dá)而阻斷腫瘤新生血管的形成而間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長［7］。Strumberg 等［8］開展了 sorafenib的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，應(yīng)用劑量范圍為50～800 mg(bid)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥的最大耐受劑量為400 mg，在超過最大耐受劑量時(shí)會有皮疹、腹瀉、疲勞以及高血壓等毒副反應(yīng)產(chǎn)生，需要停止治療。Ratain等［9］報(bào)道了一項(xiàng)隨機(jī)非連續(xù)性的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示sorafenib治療腎癌有效，顯著延長了無進(jìn)展生存期。而隨后 Escudier等［10］進(jìn)行了 sorafenib與安慰劑隨機(jī)雙盲對照的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證sorafenib治療腎癌可延長腎癌患者的無進(jìn)展生存期。根據(jù)Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，美國FDA于2005年12月批準(zhǔn)本藥在臨床上用于治療腎癌患者。

目前，有關(guān)sorafenib聯(lián)合干擾素、白介素的治療腎癌的研究甚少。本研究通過檢驗(yàn)sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清IL-2及TNF-α水平，進(jìn)一步探討sorafenib與細(xì)胞因子之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后第7天，sorafenib低劑量組及高劑量組人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2的含量低于對照組，sorafenib高劑量組人腎癌荷瘤裸鼠血清中TNF-α的含量低于對照組;而給藥后第14天，對照組、sorafenib低劑量組及sorafenib高劑量組人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均無差異。說明sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠IL-2及TNF-α的表達(dá)有影響，但影響較短暫且遠(yuǎn)期影響并不明確。此外，sorafenib與干擾素、白介素之間的具體作用方式、作用機(jī)制、遠(yuǎn)期影響等均不清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上，sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠IL-2及TNF-α的表達(dá)雖有影響，但較為短暫，遠(yuǎn)期相互作用也不明確，還需進(jìn)行更廣泛的實(shí)驗(yàn)研究，為sorafenib聯(lián)合干擾素、白介素應(yīng)用于腎癌的臨床治療提供更多的依據(jù)。

［1］袁香慶，崔傳亮，斯璐，等.化療聯(lián)合CIK細(xì)胞回輸治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌Ⅱ期臨床研究［J］.腫瘤學(xué)雜志，2008，14(5):362-365.

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［4］吳永吉，劉碩，袁愛民，等.IL-2聯(lián)合α干擾素對局部進(jìn)展期腎癌患者療效觀察［J］.河北醫(yī)藥，2009，31(22):3099-3100.

［5］Messing EM，Manola J，Wilding G，et al.PhaseⅢ study of interferon alfa-NL as adjuvant treatment for resectable renal cell carcinoma:an Eastern Cooperative Oncology Group/Intergroup trial［J］.J Clin Oncol，2003，21(7):1214-1222.

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