劉 璇，孔凡玉，張成省，王 靜，馮 超，趙 杰

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

鉀幾乎可以參與煙株體內(nèi)所有的代謝過(guò)程[1]，對(duì)煙株的物質(zhì)代謝和能量代謝有很大的影響。增施鉀肥和提高土壤中鉀的有效性是提高煙葉鉀含量的有效途徑[2-3]。然而，我國(guó)鉀肥資源較為匱乏，而且單純?cè)鍪┾浄什⒉荒芴岣邿熑~中的鉀含量[4-5]。因此，開(kāi)辟新的效果好、成本低且不污染環(huán)境的解鉀菌，充分利用土壤中的鉀素資源，對(duì)發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。

解鉀菌能夠?qū)⑼寥乐械墓潭☉B(tài)鉀分解，轉(zhuǎn)化為作物可以直接吸收利用的有效鉀，而且它分泌的一些活性物質(zhì)可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。因此解鉀菌是理想的生物肥料[6-7]。

本研究對(duì)解鉀菌進(jìn)行了解鉀能力測(cè)定和菌種鑒定，探討了解鉀菌是否可以增加培養(yǎng)液中可溶性鉀的含量，以期為制成煙草大田解鉀菌菌肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣：山東省青島市即墨采集的煙草根際土壤。鉀源：鉀長(zhǎng)石。分析純?cè)噭篘aH2PO4，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eCl3，蔗糖，CaCO3。生化試劑：瓊脂，牛肉膏，蛋白胨。主要儀器：超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，光焰光度計(jì)，高壓滅菌鍋，搖床。解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基：NaH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eCl30.05 g，蔗糖5.0 g，CaCO30.1 g，鉀長(zhǎng)石粉1.0 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 方法

本試驗(yàn)于2010年9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨基地進(jìn)行，從煙草根際土壤中分離篩選出解鉀菌。

1.2.1 鉀細(xì)菌的分離純化 取根際土樣 1 g放入100 mL解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃下進(jìn)行搖床培養(yǎng)72 h。采用10倍稀釋法，制成10-1～10-7稀釋度懸液。

取上述制成10-3～10-7稀釋度的根際菌懸液50 μL在解鉀細(xì)菌培養(yǎng)基上涂布，每一稀釋度 3個(gè)重復(fù)。在28 ℃溫箱中培養(yǎng)，以鉀細(xì)菌的菌落形態(tài)（呈玻璃珠狀，透明，凸出，挑取時(shí)有勃稠感等）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行挑取，進(jìn)一步純化，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株保藏，以便用于進(jìn)一步研究[8]。

1.2.2 解鉀菌的速效鉀產(chǎn)生能力測(cè)定 解鉀細(xì)菌的搖床培養(yǎng)：將配好的鉀細(xì)菌液體培養(yǎng)基按每瓶50 mL的裝量加入250 mL的三角瓶中，0.1MPa，20 min滅菌，冷卻后接進(jìn)1 mL解鉀菌液，并設(shè)置不接種的空白對(duì)照。接種后，28 ℃、150 rpm振蕩培養(yǎng)7 d。

上清液速效鉀測(cè)定：將在三角瓶中培養(yǎng)好的鉀細(xì)菌發(fā)酵液倒出并定容至50 mL，將發(fā)酵液在500 rpm下離心10 min，除去發(fā)酵液中的不溶性物質(zhì)，然后取10 mL的菌液10000 rpm離心10 min，取上清液測(cè)定水溶性鉀含量[9]。

1.2.3 解鉀菌的16S rDNA鑒定 模板DNA的提?。喝ゼ?xì)菌培養(yǎng)物1～5 mL（106～108個(gè)細(xì)胞，最多不超過(guò)2×109個(gè)細(xì)胞），10000 rpm離心1 min，棄凈上清。向沉淀中加入180 μL Buffer GTL，震蕩使菌體重懸。

加入20 μL Proteinase K，渦旋混勻，70 ℃孵育直至菌體完全裂解，孵育過(guò)程中每隔一段時(shí)間顛倒或震蕩離心管使樣本分散。

渦旋振蕩15 s，加200 μL Buffer GL ，渦旋振蕩充分混勻；加200 μL 無(wú)水乙醇，渦旋振蕩充分混勻（加入Buffer GL和無(wú)水乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。

將上一步所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入Spin Column DM中（Spin Column DM已放入Collection Tube），8000 rpm離心1 min，棄廢液，將Spin Column DM放回Collection Tube中。

向Spin Column DM中加入500 μL Buffer GW1（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），8000 rpm離心1 min，棄廢液，將Spin Column DM放回Collection Tube中。

向Spin Column DM中加入500 μL Buffer GW2（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），14000 rpm離心1 min，棄廢液，將Spin Column DM放回Collection Tube中。

14000 rpm離心2 min，棄廢液。將Spin Column DM置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的Buffer GW2。

將Spin Column DM轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，向膜的中間部位懸空滴加200 μL Buffer GE，室溫放置1～5 min，8000 rpm離心1 min，將溶液收集到離心管中。-20 ℃保存DNA。

反應(yīng)使用的上游引物為：

反應(yīng)使用的下游引物為：

反應(yīng)體系（50 μL）

由上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測(cè)序部測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 菌落基本特征

初篩選菌落28 ℃在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h得到8個(gè)典型菌落，并進(jìn)一步純化菌落28 ℃在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落特征見(jiàn)表1。

表1 菌落形態(tài)與菌體基本形態(tài)特征Table1 The morphology colony and basic characteristics of morphological

2.2 速效鉀產(chǎn)生能力

利用鉀長(zhǎng)石為唯一鉀源篩選培養(yǎng)基從植物根際土壤中篩選具有分解鉀礦的微生物，對(duì)所得到 8個(gè)菌株，分別擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行解鉀實(shí)驗(yàn)，以 CK（不接種）作為對(duì)照，各接種培養(yǎng)液中速效鉀增加百分比見(jiàn)圖1。

所選菌株中以菌株 K-GX4的產(chǎn)生速效鉀能力最強(qiáng)，其培養(yǎng)液中速效鉀含量增加 174.2%，K-XHJ3、K-JM-J5、K-GX5、K-GX1次之，培養(yǎng)液中速效鉀含量增加分別為 146.99%、123.21%、121.23%、101.73%。培養(yǎng)液中速效鉀含量增加小于100%的菌株為K-JM-B2、K-GX6、K-JM-B1，其速效鉀含量分別增加79.27%、47.25%、24.51%。

圖1 速效鉀增加量百分比Fig.1 Increase in the percentage of available potassium

2.3 16SrRNA基因序列分析

將測(cè)序結(jié)果輸入Gen-Bank，利用BLAST軟件，將測(cè)定得到的基因序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性分析，獲取同源性較高的相鄰的種、屬的16S rDNA序列，得到結(jié)果如表2所示。

表2 GenBank中Blast得到8種的菌株的結(jié)果Table2 The result of 8 strains in GenBand

3 討 論

從青島即墨煙草根際土壤中篩選到的8株解鉀菌，通過(guò)測(cè)定各菌株培養(yǎng)液中鉀含量來(lái)評(píng)價(jià)其解鉀能力。其中以變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）產(chǎn)生速效鉀解鉀的能力最強(qiáng)，以產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）、阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）4種菌解鉀能力較強(qiáng)，較弱的為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）、Microbacterium foliorum、擬香味類(lèi)香味菌（Myroides odoratimimus）。而且62.5%的菌株的培養(yǎng)液中速效鉀含量增加超過(guò)100%。

同實(shí)驗(yàn)室富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)條件相比，自然條件下的細(xì)菌往往處于“饑餓”狀況，而這正是細(xì)菌在自然界生活的正常環(huán)境。解鉀細(xì)菌和其他細(xì)菌一樣，在自然條件下極易受到環(huán)境條件的影響，如植物的種類(lèi)、土壤肥力、水分、日長(zhǎng)、光照強(qiáng)度、生長(zhǎng)季節(jié)的長(zhǎng)短、溫度的變化以及其他土壤微生物和原生動(dòng)物的影響，這些條件中的任何一個(gè)發(fā)生變化，都有可能直接或間接地影響解鉀菌的生長(zhǎng)。因此，盡管本研究所篩選到的解鉀菌株都具有分解鉀長(zhǎng)石礦粉的能力，但在自然環(huán)境條件下情況十分復(fù)雜，若再通過(guò)盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)相結(jié)合的方法，從改善土壤生態(tài)環(huán)境、提高肥料利用率，改善烤煙根際營(yíng)養(yǎng)水平、增強(qiáng)根系吸收能力，合理平衡、協(xié)調(diào)各生育期的營(yíng)養(yǎng)及代謝狀況等方面進(jìn)一步研究確認(rèn)后，即可作為制作微生物肥料優(yōu)先選用菌。

將解鉀菌制成生物肥料可增加煙草根際可溶性鉀的含量，有利于煙草鉀元素的吸收，從而提高煙葉產(chǎn)量和煙葉品質(zhì)。煙草生物肥料具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染、肥效長(zhǎng)、節(jié)約能源等無(wú)機(jī)肥料所不及的優(yōu)點(diǎn)[10]。從發(fā)展趨勢(shì)看，生物肥料在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將發(fā)揮越來(lái)越大的作用，代表著未來(lái)肥料發(fā)展的方向。

[1]何念祖，孟賜福.植物營(yíng)養(yǎng)原理[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987.

[2]馬朝文.中國(guó)煙葉低鉀含量的成因及解決途徑探討[J].作物研究，2006（2）：190-193.

[3]李強(qiáng)，李章海，黃義德.中國(guó)煙葉含鉀量研究現(xiàn)狀及其提高途徑探討[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（2）：452-453，455.

[4]郭合營(yíng)，劉鎮(zhèn)平，王榮，等.豫西烤煙鉀肥施用量與施肥方法試驗(yàn)研究[J].煙草科技，1995（2）：35-37.

[5]宋榮官，王鵬.烤煙鉀肥施用技術(shù)與效果研究[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，1997（1）：12-13.

[6]葛誠(chéng).微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用基礎(chǔ)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2000：1-27.

[7]農(nóng)業(yè)部肥政藥政管理辦公室.肥料登記指南[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，2002：87-96.

[8]王志成.磷鉀細(xì)菌的分離篩選與培養(yǎng)研究[J].長(zhǎng)沙電力學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，17（4）：76-78.

[9]東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[10]竇玉青，劉永中，姜鵬超，等.普利生物肥在烤煙上的應(yīng)用研究初報(bào)[J].中國(guó)煙草科學(xué).2000，21（4）：14-16.