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鏈霉素抗性突變選育那西肽高產(chǎn)菌株

2012-05-29 10:16:20高自召
中國獸藥雜志 2012年8期
關鍵詞:鏈霉素效價孢子

高自召

(浙江賜富醫(yī)藥有限公司,浙江紹興 312030)

那西肽是一種含硫多肽類抗生素,英文名Nosiheptide,是一種比較理想的飼用抗生素換代品。那西肽最先由羅納普朗克公司進行研究和試生產(chǎn),但由于其產(chǎn)量低,成本太高而未能大規(guī)模推廣。直到80年代,開始規(guī)模化生產(chǎn)。雖然之后通過育種及工藝優(yōu)化工作的持續(xù)開展,其菌種水平有了很大的提高,但菌種產(chǎn)量尚存在很大的提升空間。那西肽主要由活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosus)、抗生素鏈霉(S.antibiotics)和青灰色鏈霉菌(S.glaucogriseus)產(chǎn)生,其中以活躍鏈霉菌為最好[1]。在此,對那西肽產(chǎn)生菌出發(fā)菌株N106的孢子進行抗鏈霉素致死劑量測定,采用紫外對出發(fā)菌株孢子進行誘變處理,使誘變孢子的DNA產(chǎn)生高頻率突變,然后將突變的孢子涂布在含有鏈霉素最低抑制濃度的培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng),獲得鏈霉素抗性基因(str)突變高產(chǎn)菌株 NUS146、NUS182。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 那西肽產(chǎn)生菌N106菌株,本室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面和平板培養(yǎng)基:可溶性淀粉、牛肉膏、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀等,pH 7.2~7.4,去離子水配制。種子培養(yǎng)基:淀粉、黃豆餅粉、酵母粉、硫酸銨等,pH 7.2 ~7.4,飲用水配制。發(fā)酵培養(yǎng)基:淀粉、黃豆餅粉、硝酸鈉、硫酸鎂等,pH 7.0 ~7.5,飲用水配制。

1.1.3 硫酸鏈霉素 大連醫(yī)藥集團大連制藥廠。

1.1.4 原料和試劑 玉米漿、玉米粉、玉米淀粉、黃豆餅粉、酵母粉等均購自市場??扇苄缘矸?分析純)、NaNO3(分析純)、MgSO4(分析純)、(NH4)2SO4(分析純)、K2HPO4(分析純)、N,N - 二甲基甲酰胺(分析純)、乙醇(分析純)等。

1.1.5 儀器 Waters高效液相色譜儀、生物效價測量儀、搖床等。

1.2 方法

1.2.1 制備單孢子懸液 取N106菌株新鮮斜面,用無菌水制成孢子懸液,脫脂棉過濾,收集單孢子懸液,用血球計數(shù)法計數(shù),調整濃度為108/mL。

1.2.2 鏈霉素對N106菌株孢子的最低抑制濃度的測定 將制備好的出發(fā)菌株的孢子懸液涂布在含不同濃度(u/mL)鏈霉素的那西肽固體平板上,28℃下培養(yǎng)7 d,觀察平板上的菌落數(shù),凡是在前一個低濃度平板上已長出菌落,而在后一個較高濃度平板上未長出菌落的,后一濃度即為抗生素對出發(fā)菌株的孢子的最低致死濃度,即最低抑制濃度[2]。此試驗需要先進行預試驗,大致確定鏈霉素最低抑制濃度范圍后,再進行濃度范圍設置及正式試驗,最終確定最低抑制濃度。每次試驗條件應保持一致,如每次涂布于鏈霉素平板上的孢子懸液中孢子數(shù)量應保持在一個數(shù)量級。

1.2.3 紫外誘變最適劑量的確定 取5 mL濃度為108個/mL的孢子懸液于培養(yǎng)皿中,置紫外誘變箱(紫外燈功率15 W,253.7 nm,照射距離30 cm)中攪拌誘變,時間分別為 0(對照)、20、30、40、60、80、100 s,稀釋涂皿,28 ℃避光培養(yǎng)7 d。

1.2.4 鏈霉素抗性突變株的制備 將經(jīng)過紫外誘變的孢子懸液按0.1 mL/皿的加量涂布于含最小抑制濃度的鏈霉素培養(yǎng)基平板上,28℃避光培養(yǎng)7 d,生長出的菌落即為鏈霉素抗性突變株。

1.2.5 抗性突變株的斜面制備 將單菌落接種于那西肽試管斜面培養(yǎng)基上,28℃避光培養(yǎng)7 d,保存于冷藏冰箱,待搖瓶發(fā)酵試驗。

1.2.6 抗性突變株的搖瓶發(fā)酵實驗 斜面接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,28℃200 r/min旋轉式搖床培養(yǎng)46~48 h,然后以5%的接種量接種到裝有50 mL發(fā)酵液的500 mL三角瓶中,28℃ 200 r/min,旋轉式搖床發(fā)酵160~168 h。

1.2.7 那西肽含量的測定 用生物效價檢測法進行發(fā)酵液中那西肽含量檢測。

1.2.8 那西肽組分分析 使用Waters高效液相色譜儀對高產(chǎn)菌株與對照出發(fā)菌株發(fā)酵液進行那西肽組分分析,以確定高產(chǎn)菌株產(chǎn)生的抗生素成分。HPLC色譜條件:250 mm×4.6 mm C18反相柱,檢測波長254 nm,進樣量10 μL,流速1 mL/min,流動相為乙腈(含 0.1%TFA)、水(含 0.025% 磷酸)(50∶50)。標準品及樣品溶液制備:那西肽標準品用DMF溶解,配成1000 u/mL溶液;高產(chǎn)菌株發(fā)酵液用DMF浸提,浸提完成后取濾液用DMF稀釋成約含那西肽1000 u/mL的溶液。

1.2.9 抗性突變株的穩(wěn)定性研究 通過菌株傳代,檢測不同代數(shù)菌株的發(fā)酵目標代謝產(chǎn)物含量有無明顯變化,以判斷突變菌株的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 鏈霉素最低抑制濃度的測定 預試驗設計6個鏈霉素梯度濃度,分別為 0、0.5、1、5、10、50 u/mL,結果在鏈霉素濃度為5~50 u/mL的培養(yǎng)基上未長菌落。由此可知,鏈霉素對那西肽出發(fā)菌種N106的最小致死濃度小于5 u/mL。據(jù)此,將0~5 u/mL 再細分為0.5、1、2、3、4、5 共 6 個鏈霉素梯度濃度再次進行試驗。兩次試驗結果見表1。

表1 那西肽產(chǎn)生菌在不同濃度鏈霉素平板上的致死率統(tǒng)計表

由表1可知,那西肽產(chǎn)生菌出發(fā)菌株對鏈霉素極度敏感,低劑量的鏈霉素就能使死亡率達到90%以上。隨著鏈霉素濃度的增加,出發(fā)菌株在篩選平板上的單菌落逐漸減少,當鏈霉素濃度為1 u/mL時,菌落生長就受到很大影響,生長變慢,明顯小于對照,并出現(xiàn)一些全禿或半禿的菌落。當鏈霉素濃度達到3 u/mL時,篩選平板上無單菌落形成,故鏈霉素對N106菌株的最小抑制劑量為3 u/mL。

2.2 紫外致死曲線的繪制 紫外照射劑量與致死率之間在一定范圍內存在明顯的劑量效應關系見圖1。

圖1 紫外線照射N106致死率曲線圖

由圖1可以看出,隨著照射時間的延長,致死率逐漸升高,當照射時間超過60 s時,致死率達到90%以上。一般認為殺菌率以90.0% ~99.9%效果較好,但也有報道認為,較低的殺菌率有利于正突變菌株的產(chǎn)生[3]。因此,本次試驗選用致死率達到90%但并非最高的60 s作為紫外線誘變劑量。

2.3 鏈霉素抗性突變株的篩選 通過紫外誘變及鏈霉素抗性篩選,在鏈霉素濃度為3 u/mL的篩選培養(yǎng)基平板上分離得到213株抗性菌株,經(jīng)單菌落發(fā)酵初篩后有26株效價高于出發(fā)菌株。將初篩效價高的單菌落移植斜面,經(jīng)過兩次搖瓶發(fā)酵,用生物效價檢測方法測定那西肽抗性菌株效價。兩次復篩效價均值結果見表2。

表2 那西肽抗性菌株復篩效價均值統(tǒng)計 u/mL

可以看出,本次利用鏈霉素抗性基因突變篩選法獲得搖瓶發(fā)酵效價達3000 u/mL以上的高產(chǎn)菌株共有8株,約占抗性菌株的4%,最高產(chǎn)量菌株NUS182效價較出發(fā)菌株效價提高37.97%。

2.4 高產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物研究 兩個高產(chǎn)菌株NUS182、NUS143與對照菌株N106在同樣工藝條件下,同時進行搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵液進行HPLC檢測(圖2)。由HPLC圖譜可以看出,以上獲得的高產(chǎn)菌株NUS182、NUS143產(chǎn)生的那西肽圖譜與對照菌種一致,說明誘變菌株NUS182、NUS143效價水平的提高是那西肽產(chǎn)量增加所致。

圖2 高產(chǎn)菌種NUS182、NUS143與對照菌種N106搖甁發(fā)酵液HPLC圖譜

2.5 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性研究

2.5.1 高產(chǎn)菌株傳代試驗 取 NUS146、NUS182菌株的孢子甘油凍存管,將凍存孢子轉接至試管斜面培養(yǎng)上,28℃培養(yǎng)7 d后作為F1代,從F1代斜面轉接斜面后F1代冰箱保存,同樣28℃培養(yǎng)7 d為F2代,同樣方式接連傳代到F4,然后分別將F1、F2、F3、F4斜面同時轉接斜面擴大培養(yǎng),28℃培養(yǎng)7 d,即為 F2、F3、F4、F5代。

2.5.2 傳代菌株的搖瓶發(fā)酵 取上述分別培養(yǎng)了7 d 的 F2、F3、F4、F5代孢子斜面,鏟塊(相同大小的菌塊)接種到種子培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)2 d,然后轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,28℃培養(yǎng)7 d。重復試驗3批,平均效價及相對于F2代的效價增減幅度均值統(tǒng)計情況見表3。

表3 那西肽抗性高產(chǎn)菌株發(fā)酵水平驗證

由表3可知,高產(chǎn)突變株NUS146及NUS182均表現(xiàn)為:F3~F4代高產(chǎn)性能相對穩(wěn)定,F(xiàn)5代產(chǎn)量分別下降了14.98%、13.03%,生產(chǎn)上不可行,故該菌種作為生產(chǎn)菌種使用時,應注意最多傳至4代,傳代過多,生產(chǎn)水平具有下降的風險。

3 討論

3.1 鏈霉菌產(chǎn)抗生素能力與鏈霉素抗性基因之間的對應關系是抗生素科研領域的一個研究熱點[4],用鏈霉素作為致死抗藥性突變標志定向篩選誘變后的菌株,有一定的方向性,能極大地提高篩選效率。

3.2 紫外誘變是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的誘變方法之一,但由于該方法所致的發(fā)生變異的不定向性與篩選的盲目性,往往篩選工作量大而且效果不佳。本文將傳統(tǒng)誘變方法篩選那西肽產(chǎn)生菌突變株結合鏈霉素抗性篩選法,在增大突變率的同時,又提高突變菌株的正變率達到12.21%,并篩選到了幾株高產(chǎn)菌株,表明對那西肽菌種誘變后以鏈霉素抗性作為篩選模型對那西肽菌種水平的提高十分有效。

3.3 在此基礎上,可復合鏈霉素篩選模型對那西肽菌種進行其他理化因子的誘變嘗試。另外,本研究對其他鏈霉菌品種的高效育種也有一定的借鑒意義。

[1]李紅軍,鄒曉庭.一種新型飼料添加劑[J].飼料研究,2004,2:17.

[2]江 凌,鄔建國,陳偉偉,等.鏈霉素抗性突變-萬古霉素高產(chǎn)菌株的選育研究[J].中國抗生素雜志,2005,30(2):70 -71.

[3]施巧琴,吳松剛.工業(yè)微生物育種學[M].北京:科學出版社,2009:38.

[4]楊東靖,陳冠群,陳 巍,等.鏈霉素抗性突變—納他霉素高產(chǎn)菌株的選育研究[J].微生物學通報,2003,30(4):31.

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