李 偉，秦紅剛，張 萍，漆世華，朱 薇，王 威，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的新型表達(dá)載體系統(tǒng)，據(jù)報道現(xiàn)已成功應(yīng)用于500多種外源蛋白的表達(dá)［1］。相比貼壁依附型的哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞可直接進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而更具有優(yōu)越性。不同昆蟲細(xì)胞系在不同培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)及代謝參數(shù)已有文獻(xiàn)報道［2］。理論及實(shí)驗表明，利用重組桿狀病毒感染高密度的Sf9細(xì)胞可獲得高水平的外源蛋白的表達(dá)［3］。本文對Sf9細(xì)胞在Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基和僅添加10%血清的Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長情況進(jìn)行了比較，同時利用Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基從搖瓶放大到14 L攪拌式生物反應(yīng)器對培養(yǎng)工藝做了研究，為昆蟲細(xì)胞的大規(guī)模高密度培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 Sf9昆蟲細(xì)胞由美國 Newport＆Prota tek公司惠贈，經(jīng)搖瓶懸浮培養(yǎng)馴化所得。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基及添加劑PF68、Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自Gibco公司;小牛血清購自武漢三利生物技術(shù)有限公司;葡萄糖、氨、乳酸、谷氨酰胺及總氨基酸檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)搖床為上海智誠分析儀器制造有限公司;分光光度計為上海尤尼柯2100可見分光光度計;生物反應(yīng)器為荷蘭Applikon 14L攪拌式生物反應(yīng)器。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞監(jiān)測 細(xì)胞通過血球計數(shù)板來計數(shù)，經(jīng)臺盼藍(lán)染色來測定細(xì)胞活性。

1.2.2 生化分析 葡萄糖、氨、乳酸、谷氨酰胺及總氨基酸的測定嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果在紫外可見光分光光度計上測得。

1.2.3 Sf9細(xì)胞搖瓶懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞經(jīng)克氏瓶靜止培養(yǎng)復(fù)蘇后，以傳代后初始密度不低于每毫升2.5×105的接種量逐步放大到250 mL搖瓶，搖瓶裝液體積為50～100 mL，要求細(xì)胞生長密度不高于5×106/mL時進(jìn)行傳代。Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基中添加0.1%的 Pluronic F68，Grace培養(yǎng)基中添加10%的小牛血清，培養(yǎng)溫度27～30℃，搖床轉(zhuǎn)速100～120 r/min。

1.2.4 Sf9細(xì)胞生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng) 將搖瓶種子細(xì)胞逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，按接種生物反應(yīng)器細(xì)胞初始密度不低于2.5×105/mL的接種量接種。培養(yǎng)基中加入0.1%的Pluronic F68，采用Vortex攪拌漿微泡通氣模式，培養(yǎng)溫度27～30℃，攪拌轉(zhuǎn)速150～200 r/min，DO控制在50% ～80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基搖瓶懸浮培養(yǎng) Sf9細(xì)胞在250 mL搖瓶中培養(yǎng)的生長曲線見圖1。細(xì)胞初始密度為2.8×105/mL，接種細(xì)胞后4～16 h細(xì)胞生長處于靜止期，16～28 h細(xì)胞開始逐步適應(yīng)開始快速生長，28～88 h細(xì)胞處于對數(shù)生長階段，此時細(xì)胞生長不受限制，細(xì)胞比生長速率為0.032/h(圖2)，倍增時間為20 h，且對數(shù)生長期可維持60 h以上。整個培養(yǎng)過程細(xì)胞活性在90%以上，細(xì)胞分散良好。

2.2 Grace培養(yǎng)基添加有10%血清搖瓶懸浮培養(yǎng)將無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞懸液離心后重懸于添加10%小牛血清的Grace基本培養(yǎng)基中，適應(yīng)培養(yǎng)48 h后傳代，接種250 mL搖瓶，細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)生長情況如圖3。初始細(xì)胞密度為4.3×105/mL，細(xì)胞比生長速率不高于0.02/h，計數(shù)細(xì)胞倍增時間約為37 h，且細(xì)胞生長狀態(tài)不是很好，繼續(xù)傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎不生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭狀。嘗試在培養(yǎng)基中添加0.5%的Pluronic F68，效果依然沒有改善?？梢娞砑佑?0%血清的Grace基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比無血清Sf900Ⅱ培養(yǎng)基效果要差。有文獻(xiàn)報道在培養(yǎng)基中添加酵母水解物和乳清蛋白水解物Sf9細(xì)胞生長良好［4］。

圖3 Sf9細(xì)胞Grace培養(yǎng)基細(xì)胞生長曲線

2.3 Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基添加1%血清懸浮培養(yǎng)血清有促進(jìn)細(xì)胞生長性能且對細(xì)胞生長有剪切保護(hù)的作用［5］。為進(jìn)一步提高Sf9細(xì)胞活性及生長速率，嘗試在Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基中添加1%的小牛血清考察其生長情況，同時設(shè)Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基作對照。細(xì)胞培養(yǎng)60 h后傳代，情況如圖4所示。可以看出，血清的加入對細(xì)胞生長速率及細(xì)胞活性的提高有一定的影響，傳代培養(yǎng)60 h細(xì)胞生長密度提高30%，細(xì)胞活性提高3%?？梢娞砑优Ｑ鍖?xì)胞生長及活性提高有比較顯著的促進(jìn)作用，但產(chǎn)品的質(zhì)量風(fēng)險也隨之增加。

圖4 Sf9細(xì)胞無血清培養(yǎng)基與添加1%血清生長對照

2.4 攪拌式生物反應(yīng)器Sf900Ⅱ無血清懸浮培養(yǎng)為了擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，嘗試用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，種子細(xì)胞來源于搖瓶懸浮培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大到一定體積后接種生物反應(yīng)器，初始細(xì)胞密度不低于2.5×105/mL，每隔12 h取樣計數(shù)并作檢測，結(jié)果如圖5－圖10所示。圖5顯示，細(xì)胞在前36 h生長緩慢，可能與接種細(xì)胞密度低有關(guān);細(xì)胞培養(yǎng)120 h達(dá)到最高細(xì)胞密度1.4×107/mL，這時細(xì)胞活性顯著下降到80%以下，取樣觀察此時細(xì)胞有部分結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。有報道稱，乳酸的積累可能是引起細(xì)胞結(jié)團(tuán)的重要原因［6］。整個培養(yǎng)過程，葡萄糖作為最重要的碳源，其總的消耗量約為初始含量的3/4(圖6)，谷氨酰胺作為主要的氮源物質(zhì)變化不明顯(圖7)。細(xì)胞培養(yǎng)后期，副產(chǎn)物乳酸和氨積累較為明顯(圖8、圖9)，這可能是引起細(xì)胞活性降低的重要原因之一。整個過程中，培養(yǎng)基中總氨基酸的消耗量不足初始總氨基酸含量的1/4(圖10)，主要氨基酸的耗盡也會嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長［7］。

3 討論

3.1 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用無血清低蛋白培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白類藥物是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。利用Sf900Ⅱ無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf9昆蟲細(xì)胞具有細(xì)胞密度高，培養(yǎng)基成分明確，且易于大規(guī)模懸浮培養(yǎng)等具有更好的應(yīng)用前景。

3.2 血清對細(xì)胞生長有一定的保護(hù)作用，可明顯提高細(xì)胞的活性，本文也從實(shí)驗中驗證了這一觀點(diǎn)。但隨后的實(shí)驗也發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的不斷適應(yīng)培養(yǎng)和傳代，血清對細(xì)胞活性的改善不明顯。

3.3 動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)是其工業(yè)化的前提。利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Sf9細(xì)胞可獲得較高的細(xì)胞密度，但后期細(xì)胞活性明顯下降，分析原因如下:

①氣泡。生物反應(yīng)器培養(yǎng)后期細(xì)胞密度比較高，為了滿足溶氧需求，過程需增大通氣量，故而會形成較多的氣泡，而氣泡破裂形成的張力對細(xì)胞剪切損傷比較大［8］。

②攪拌。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞對攪拌敏感性較添加了血清培養(yǎng)的更高。

③營養(yǎng)物質(zhì)的限制和代謝副產(chǎn)物的積累。培養(yǎng)過程中總的氨基酸的消耗，特別是主要氨基酸的消耗可能會限制細(xì)胞生長，代謝副產(chǎn)物如乳酸、氨的積累過多會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，對細(xì)胞的生長有比較大的抑制作用。

④滲透壓。細(xì)胞生長有一個適宜的滲透壓范圍，隨著后期代謝產(chǎn)酸，培養(yǎng)液中滲透壓會隨之升高，引起細(xì)胞活性水分子的流失，是培養(yǎng)后期細(xì)胞活性降低的一個重要原因。通過不斷優(yōu)化培養(yǎng)工藝條件，如改變通氣和攪拌方式，設(shè)計個性化培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)方式及補(bǔ)料策略等來改善細(xì)胞活性有待進(jìn)一步研究，為今后利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)蛋白類藥物打下基礎(chǔ)。

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