邵攀峰，余彬輝，何葉峰，李少麗，王斌卿，胡志航，朱國坡

(杭州薦量獸用生物制品有限公司，杭州 310018)

雞減蛋綜合征是由雞減蛋綜合征病毒(EDSV－76)引起的以產(chǎn)生薄殼或無殼蛋，產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降為主要特征的傳染病。自1976年荷蘭科學(xué)家Van Eck等首次報(bào)道以來，許多國家及地區(qū)都報(bào)道了此病的流行，此病已成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)引起產(chǎn)蛋損失的主要原因之一［1］。目前，國內(nèi)外均采用油乳劑滅活疫苗預(yù)防本病。為了減少因免疫次數(shù)多對雞群的應(yīng)激反應(yīng)，近年來國內(nèi)對聯(lián)苗的研究也更加重視［2］。

本實(shí)驗(yàn)通過對雞減蛋綜合征病毒液高倍濃縮，然后根據(jù)不同稀釋濃度抗原含量制備滅活疫苗，研究其抗體效價(jià)水平，為雞減蛋綜合征滅活疫苗，特別是雞新城疫－減蛋綜合征二聯(lián)滅活疫苗、雞新城疫－傳染性支氣管炎－減蛋綜合征三聯(lián)滅活疫苗、雞新城疫－傳染性支氣管炎－減蛋綜合征－禽流感四聯(lián)滅活疫苗等與雞減蛋綜合征相關(guān)的多聯(lián)滅活疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒種及抗原 EDSV HE02株生產(chǎn)毒種由杭州薦量獸用生物制品有限公司保存，EDS HI抗原及陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 種蛋及試驗(yàn)雞 發(fā)育良好的10日齡普通鴨胚作為制苗材料，種蛋EDS HI抗體不高于1∶4;SPF雞由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購進(jìn)SPF種蛋，孵化后置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器與試劑 Pellicon切向流超濾系統(tǒng)、膜Bioma×100面積為0.5 m2的標(biāo)準(zhǔn)膜堆均購自密理博中國有限公司。酪胨瓊脂(G.A)、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)、葡萄糖蛋白胨湯(G.P)購自北京中海動(dòng)物保健科技公司。

1.2 方法

1.2.1 雞減蛋綜合征病毒液的制備 選擇發(fā)育良好的10日齡易感鴨胚，取生產(chǎn)用種毒100倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種，0.1 mL/胚。接種后密封針孔，置37.8℃下繼續(xù)孵育，不必翻蛋。鴨胚接種后，每日照蛋一次，將72 h前死亡的鴨胚棄去。此后，每4～6 h照蛋1次，死亡的胚隨時(shí)取出，直至120 h，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷卻24 h。將冷卻的鴨胚取出，無菌吸取尿囊液，若干個(gè)鴨胚分為一組，吸取尿囊液放于同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣測定血凝價(jià)，低于1∶10240(微量法)者棄去，將血凝價(jià)合格的尿囊液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

1.2.2 病毒液的濃縮 先將病毒液用滅菌的100目/cm2的不銹鋼漏斗濾過，再用離心機(jī)3000～5000 r/min離心10 min，進(jìn)行預(yù)過濾。然后將預(yù)過濾的盛有病毒液的容器通過無菌管道與超濾裝置連接，并反復(fù)循環(huán)通過超濾裝置，直至達(dá)到要求的濃縮終點(diǎn)。

1.2.3 病毒含量測定 將病毒液用滅菌生理鹽水10 倍系列稀釋，取 10－6、10－7、10－83 個(gè)稀釋度，接種已長成單層鴨胚成纖維細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種0.1 mL，每個(gè)稀釋度接種6孔，觀察120 h，記錄各孔的細(xì)胞病變情況，計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.4 紅細(xì)胞凝集價(jià) 參照《中華人民共和國獸藥典》附錄中紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(微量法)［3］進(jìn)行測定。

1.2.5 滅活 濃縮后測定病毒含量合格的病毒液，按體積加入10%的甲醛溶液，至終濃度為0.1%(V/V)，充分振蕩均勻，37℃恒溫滅活16 h。滅活后逐瓶抽樣，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。

1.2.6 無菌檢驗(yàn) 參照《中華人民共和國獸藥典》附錄中無菌檢驗(yàn)方法［3］。

1.2.7 滅活檢驗(yàn) 取10日齡易感鴨胚5枚，尿囊腔接種滅活后的鴨胚尿囊液，0.1 mL/枚，每日照蛋2次，連續(xù)觀察5 d。對所有胚液分別測定血凝價(jià)，無論是否出現(xiàn)血凝，均應(yīng)盲傳1代，測定血凝性，均為陰性時(shí)，判定滅活完全。

1.2.8 疫苗制備 將滅活后的EDSV抗原液用滅菌生理鹽水進(jìn)行 1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1∶256稀釋。參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》中雞減蛋綜合征滅活疫苗制備方法［4］，制備不同抗原含量的滅活疫苗。

1.2.9 疫苗的性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定 參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》附錄［4］對各批疫苗進(jìn)行性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定。

1.2.10 動(dòng)物分組免疫 將70只21日齡SPF雛雞隨機(jī)分為7組，10只/組。按照抗原含量1∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 的稀釋倍數(shù)分免疫組和空白對照組。頸部皮下接種，0.5 mL/只。

1.2.11 HI抗體效價(jià)測定 免疫后21 d，每只雞分別翅靜脈采血，分離血清。參照《中華人民共和國獸藥典》附錄中血凝抑制試驗(yàn)方法［3］，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 制苗用病毒液的生產(chǎn)情況及濃縮前后的檢驗(yàn)EDS病毒液經(jīng)過Pellicon切向流超濾系統(tǒng)濃縮至6.5倍，濃縮前后的檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 制苗用病毒液制備及濃縮前后檢驗(yàn)情況匯總

2.2 制苗用病毒液的無菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)結(jié)果EDSV滅活病毒液接種易感鴨胚盲傳1代，測定HA效價(jià)，所有樣品均呈HA陰性且胚胎發(fā)育正常，滅活檢驗(yàn)合格，結(jié)果見表2。

表2 制苗用病毒液無菌及滅活檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 疫苗的性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定 對各批疫苗進(jìn)行了性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定，結(jié)果完全能夠達(dá)到規(guī)程中的各項(xiàng)要求，結(jié)果見表3。

表3 成品檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 HI抗體效價(jià)測定 接種后21 d，每只雞分別采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測定，結(jié)果見表4。

表4 免疫后各試驗(yàn)組雞血清中HI抗體效價(jià)水平 log2

3 討論

EDSV具有較好的免疫原性，由其制備的雞減蛋綜合征滅活疫苗對抵抗強(qiáng)毒攻擊具有較高的保護(hù)率［5］。提高單位體積的抗原含量是聯(lián)苗生產(chǎn)的技術(shù)關(guān)鍵，而抗原濃縮是達(dá)到此目的的理想辦法［6－9］。多次雞減蛋綜合征病毒液濃縮試驗(yàn)結(jié)果證明，本試驗(yàn)選用的美國密理博公司的超濾濃縮裝置系統(tǒng)，對雞減蛋綜合征病毒液濃縮效果較好，使用方便。濃縮過程濾出廢棄液中無抗原成分濾出，沒有抗原成分損失。HA效價(jià)和病毒含量與濃縮倍數(shù)在一定程度上呈正相關(guān)［10］，通過對濃縮后病毒液HA效價(jià)和TCID50的控制，可以保證使用濃縮后的胚液配苗。

本試驗(yàn)利用血凝抑制試驗(yàn)方法，測定免疫雞第21天抗體效價(jià)水平，評價(jià)免疫后血清中的抗體水平。結(jié)果表明:隨著抗原含量的降低，HI抗體效價(jià)水平也下降，濃縮6.5倍的滅活抗原再稀釋256倍制備的雞減蛋綜合征滅活疫苗，雖然免疫雞抗體效價(jià)的幾何平均值達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，但是已有3/10不符合標(biāo)準(zhǔn)，且有4只免疫雞僅僅符合標(biāo)準(zhǔn)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中不建議使用此濃度稀釋抗原配苗。研究表明:制備與雞減蛋綜合征相關(guān)的多聯(lián)滅活疫苗，雞減蛋綜合征病毒液可根據(jù)HA效價(jià)和病毒含量適當(dāng)調(diào)整濃縮倍數(shù)，以便確保疫苗質(zhì)量和節(jié)約生產(chǎn)成本。

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