郝利華，于曉輝，董玲玲，萬仁玲，宋 洋

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266000)

黃芪多糖注射液具有提高機(jī)體免疫力的功效，在獸醫(yī)臨床上作為輔助治療應(yīng)用廣泛。但一些不法企業(yè)利用中藥成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對落后等缺點(diǎn)，在該注射液中非法添加化學(xué)類藥物，以在短時(shí)間內(nèi)起到明顯的療效，對用藥安全帶來巨大風(fēng)險(xiǎn)。本文采用旨在建立快速、簡便的方法以檢測出其中添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物:安乃近、安替比林、對乙酰氨基酚和氨基比林。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Waters 2695，二極管陣列檢測器2998(PDA)，美國waters公司;METTLER AE240精密天平，精度0.01 mg，梅特勒精密儀器廠。安乃近對照品:批號H0291105，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;安替比林對照品:批號H0020907，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;對乙酰氨基酚對照品:批號100018－200408，中國藥品生物制品檢定所;氨基比林(高純試劑):中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。供試品:25批不同廠家黃芪多糖注射液，市場購買;黃芪多糖提取物(含量以葡萄糖計(jì)25%):中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［1－2］與系統(tǒng)適用性 色譜柱采用迪馬鉆石 C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以磷酸鹽緩沖液磷酸二氫鈉6.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺1mL，用氫氧化鈉試液調(diào)pH值至7.0)－甲醇(70 ∶30，V/V)為流動(dòng)相;進(jìn)樣量 10 μL，流速1.0 mL/min。采用二極管陣列檢測器，采集波長范圍為190～400 nm，分辨率為1.2 nm，記錄229 nm波長處的色譜圖。

2.2 分離度測定 分離度測定溶液:取安乃近對照品60 mg，安替比林、氨基比林、對乙酰氨基酚對照品各25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。(參照分離度測定溶液，分別制備對照品溶液，濃度分別為安乃近0.48 mg/mL，氨基比林、安替比林和對乙酰氨基酚0.24 mg/mL)。

供試品溶液:精密量取供試品1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

陰性對照溶液(無添加黃芪多糖溶液):取黃芪多糖提取物4 g(25%)，加水100 mL制成每1 mL中含0.1g(以葡萄糖計(jì))的溶液。

取上述分離度測定溶液及陰性對照溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見圖1。四種待測成分完全分離，且陰性對照對測定結(jié)果無影響。

圖1 分離度測定結(jié)果色譜圖

2.3 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各色譜圖峰面積。結(jié)果各主峰峰面積RSD均小于0.8%，表明精密度較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對照品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，結(jié)果各主峰峰面積RSD均小于1.2%，表明穩(wěn)定性較好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取安乃近對照品30、24、36 mg各三份，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別加陰性對照溶液各0.1 mL，按混合對照品溶液制備中稀釋步驟稀釋。

分別取安替比林、對乙酰氨基酚、氨基比林對照品10、12.5、15 mg 各三份，精密稱定，置 25 mL量瓶中，加陰性對照溶液0.2 mL，照混合對照品溶液制備稀釋步驟稀釋。

按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果顯示，安乃近、安替比林、氨基比林和對乙酰氨基酚的平均回收率分別為99.2%、99.9%、99.4%和100.3%;RSD 分別為 0.4%、0.5%、0.3%和0.7%。

2.6 線性與范圍 取安乃近對照品約60 mg，安替比林、氨基比林、對乙酰氨基酚各25 mg，一同置于50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1、3、5、7、9 mL 于 25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測定安乃近、安替比林、氨基比林、對乙酰氨基酚峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.7 檢測限 黃芪多糖儲備液(安乃近檢測限用):取陰性對照溶液0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

黃芪多糖儲備液(安替比林、氨基比林、對乙酰氨基酚檢測限用):取陰性對照溶液0.2mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。

檢測限溶液制備:分別取安乃近、安替比林、氨基比林、對乙酰氨基酚對照品溶液加甲醇進(jìn)一步稀釋至適宜濃度，加對應(yīng)黃芪多糖儲備液5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，依法測定。光譜圖失真前的濃度為該測試藥物的檢測限，光譜圖未失真且S/N≥10為定量限。

2.8 耐用性試驗(yàn) 取混合對照品溶液，分別采用迪馬 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、AT LiCHROM C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Alltima C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)三種色譜柱，改變流動(dòng)相比例，水相—有機(jī)相分別為70∶30、65∶35和75∶25，按上述方法操作，結(jié)果四種成分仍能很好地分離且保留時(shí)間合理。在最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇中流速的變化影響也不大，本方法的耐用性較好。

2.9 樣品測定及結(jié)果判斷 供試品溶液制備:取供試品1 mL，加甲醇100.0 mL，搖勻即得。按2.2項(xiàng)方法制備各對照品溶液。分別精密量取供試品溶液與各對照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件對25批供試品進(jìn)行測定。供試品色譜圖中如出現(xiàn)色譜峰與相應(yīng)對照品峰保留時(shí)間一致(差異小于等于±5%);在大于190 nm的波長范圍內(nèi)，供試品出現(xiàn)的色譜峰與相應(yīng)對照品色譜峰相對峰高大于10%時(shí)，兩者光譜圖無明顯差異(必要時(shí)可調(diào)整供試品溶液的濃度);最大吸收波長一致(差異小于等于±2 nm)，判為檢出被測試藥物。

結(jié)果顯示25批樣品中7批檢出安乃近，1批檢出對乙酰氨基酚，結(jié)果見表3。色譜圖及光譜圖見圖2。

表3 樣品測定結(jié)果 mg/mL

其中100109除檢出對乙酰氨基酚，100201、20100201、20100901除檢出安乃近外，另有峰的保留時(shí)間、光譜指數(shù)圖(見圖2)非本文所列的目標(biāo)化合物，其成分有待進(jìn)一步分析。

圖2 對照品、陽性樣品光譜指數(shù)圖及色譜圖

3 討論

3.1 HPLC－PDA檢測方法利用待測物與其對應(yīng)的對照品有相同的最大吸收波長，兩者之間的偏差應(yīng)在±2 nm之內(nèi)，另根據(jù)保留時(shí)間的一致性可確定檢出藥物與其對應(yīng)對照品為同一物質(zhì)，而進(jìn)行定性與定量測定。

3.2 本試驗(yàn)分別采用水、甲醇、甲醇－水(30∶70)為溶媒，進(jìn)行了四種藥物的溶解比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶媒中含水時(shí)，安乃近易降解，見圖2中安乃近對照品色譜圖(3)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，主要降解產(chǎn)物為4－甲氨基安替比林［3］(MAA)。因而最終確定以甲醇為溶媒。在樣品測定時(shí)，樣品為水溶液，均可檢測到MAA，因此測定結(jié)果中安乃近的含量并不能完全反應(yīng)其實(shí)際添加量。

3.3 取相應(yīng)對照品加甲醇稀釋制成一定濃度的溶液，在本色譜條件下進(jìn)樣，確定該化合物的峰位并提取其光譜圖指數(shù)圖，以上四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物在229 nm左右均有吸收，且考慮安乃近在其他波長處吸收較弱并參考有關(guān)文獻(xiàn)［2］，選擇229 nm作為檢測波長。

3.4 四種藥物藥效濃度不同，在黃芪多糖注射液中的添加量也不同，本研究在做回收試驗(yàn)時(shí)，以各藥物在注射液中的規(guī)格為100%添加。樣品測定時(shí)，供試品溶液濃度可能與對照品濃度不匹配，因摻假過程復(fù)雜，有的非只加一種成分，因此可根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整供試品取樣量，使檢出成分色譜峰峰面積盡可能與對照品峰面積接近。

4 結(jié)論

在該色譜系統(tǒng)中黃芪多糖無紫外吸收對檢出無干擾，因此可通過樣品峰與對照品峰的保留時(shí)間、峰純度以及光譜特征三方面的對比來確定黃芪多糖注射液中是否非法添加有該4種藥物，方法簡單、重復(fù)性好。本文檢測了25批市售黃芪多糖注射液，發(fā)現(xiàn)1批添加對乙酰氨基酚;7批檢出安乃近。由于化學(xué)藥品添加量一般較大，因此摻偽的色譜峰容易識別。使用本文的方法，可以使黃芪多糖注射液中的非法添加檢出更簡單、系統(tǒng)。

［1］劉紅云，鄭 舉，張 莉，等.HPLC法同時(shí)測定安痛定注射液中氨基比林和安替比林的含量［J］.中國獸藥雜志，2009，43(9):5－7

［2］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版二部［S］.

［3］沈金燦，龐國芳，謝麗琪，等.牛和豬肌肉組織中安乃近代謝物殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析［J］.化學(xué)分析，2007，35(11):1565－1569.