朱春雷 呂樹振 趙世偉

當(dāng)周圍神經(jīng)損傷后，脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體都會(huì)發(fā)生損傷性反應(yīng)，都有一定數(shù)量的神經(jīng)元胞體死亡，神經(jīng)元胞體的變化在再生調(diào)控中起重要的作用，而神經(jīng)元胞體內(nèi)的變化是錯(cuò)中復(fù)雜的，研究周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)元凋亡途徑的激活等對抑制神經(jīng)元的凋亡、加強(qiáng)神經(jīng)元胞體的保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)有重要意義。胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一員，它的信號傳遞途徑涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育及分裂，是信號網(wǎng)絡(luò)核心，ERK1/2通過細(xì)胞分裂周期影響增殖與分化，對細(xì)胞凋亡的抑制、創(chuàng)傷愈合、神經(jīng)的再生起重要作用[1]。目前對坐骨神經(jīng)切斷后P-Erk-1/2的表達(dá)變化，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠坐骨神經(jīng)切斷術(shù)后在不同時(shí)相P-ERK1/2表達(dá)的檢測，為神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室購置10W～12W成年Wister大鼠（約250克）共80只，并隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）和坐骨神經(jīng)切斷組（B組），每組40只；

主要試劑：一抗P-ERK1/2-1（Promega公司）、β-actin（Sigma公司）、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒( Santa Cruz 公司)，使用濃度及方法嚴(yán)格按照說明書配置。

1.2 模型制備與取材 3%戊巴比妥鈉40 mg／kg腹腔麻醉大鼠后常規(guī)消毒，做右側(cè)臀部斜切口,鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)。假手術(shù)組中的動(dòng)物模型暴露坐骨神經(jīng)后逐層縫合皮膚；將坐骨神經(jīng)切斷組中的動(dòng)物模型的坐骨神經(jīng)完全切斷,在12倍手術(shù)顯微鏡下將其神經(jīng)兩端正確對位后，用9-0無損傷線吻合斷端4～6針，并逐層縫合皮膚。

取材：將每組5只大鼠，經(jīng)3%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，待生效后常規(guī)消毒，切取L4～L6段脊髓右側(cè)標(biāo)記好后浸置于液氮中備有。

1.3 western- blot方法 快速將液氮中的組織取出，分離提取蛋白，測定濃度，每泳道15ug總蛋白進(jìn)行10% SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PDVF膜，一抗p-Erk1/2抗體(1:2,500)，4℃搖床輕搖孵育過夜，二抗Goat Anti Rabbit IgG, FITC偶聯(lián)抗體（1：5000）室溫?fù)u床輕搖2h；按ECL 顯色試劑盒說明書操作顯色，X 光膠片曝光，然后進(jìn)行條帶掃描和分析P-ERK1/2表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將western-blot條帶掃描和分析，各組數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS10.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間t檢驗(yàn)比較，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

P-Erk1/2隨時(shí)相的改變在脊髓中表達(dá)情況 通過應(yīng)用western-blot方法對大鼠坐骨神經(jīng)切斷后相應(yīng)脊髓階段中PErk1/2表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn)，P-Erk1/2在L4～L6在脊髓中的表達(dá)隨時(shí)間的變化而改變，如圖2所示，在假手術(shù)組中脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的P-ERK1/2僅有少量表達(dá)并維持一定的水平；坐骨神經(jīng)切斷組在坐骨神經(jīng)切斷后1W內(nèi)P-ERK1/2表達(dá)增加、2W達(dá)高峰、8W恢復(fù)正常水平。各組間數(shù)據(jù)分析在1W～4W組中PErk1/2表達(dá)坐骨神經(jīng)切斷組明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、圖2。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后P-Erk1/2在脊髓中的表達(dá)Fig1.Expression of phospho-Erk1/2 in rat spinal cord after sciatic nerve transaction

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后P-Erk1/2在脊髓中的分析

3 討論

有關(guān)神經(jīng)損傷后胞體反應(yīng)性的變化的研究結(jié)果認(rèn)為，神經(jīng)損傷后胞體的變化主要與神經(jīng)元的類型、生物體的年齡、損傷部位到胞體的距離、軸突延伸的環(huán)境、神經(jīng)元的興奮性及損傷類型有關(guān)[1]，而這些因素又與神經(jīng)損傷后的再生特性密切關(guān)聯(lián)，在周圍神經(jīng)損傷與再生過程中神經(jīng)元胞體內(nèi)在自身修復(fù)的過程中發(fā)生一系列的變化，同時(shí)存在細(xì)胞間的微環(huán)境變化及信號的產(chǎn)生與傳導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用western-blot方法分析、比較假手術(shù)組與坐骨神經(jīng)切斷組在不同時(shí)相P-Erk1/2蛋白量的表達(dá)變化，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看到在假手術(shù)組中也存在著P-ERK1/2的表達(dá)，但表達(dá)的量較低，而且不隨時(shí)間的變化而發(fā)生改變，說明了手術(shù)并不會(huì)對相應(yīng)節(jié)段脊髓P-Erk1/2蛋白量的表達(dá)產(chǎn)生影響，在坐骨神經(jīng)切斷組中1W時(shí)已經(jīng)呈陽性表達(dá)，在2W時(shí)達(dá)到高峰后逐漸下調(diào)，至8W時(shí)其表達(dá)接近假手術(shù)組水平，由此可見P-ERK1/2的表達(dá)具有時(shí)間依賴性，同時(shí)我們也注意到假手術(shù)組和坐骨神經(jīng)切斷組在各時(shí)相的表達(dá)存在差異：在術(shù)后1W時(shí)坐骨神經(jīng)切斷組中P-ERK1/2表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，說明坐骨神經(jīng)切斷后帶來的刺激在1W內(nèi)就激活了MAPK /ERK1/2信號通路，活化后的ERK(p-ERK)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)對轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，這樣它就起到一個(gè)承上啟下的作用，將胞外信號傳導(dǎo)到核內(nèi)[2]。被激活的ERK將特定的底物磷酸化，如磷脂酶、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白等，通過這一途徑，被激活的蛋白質(zhì)發(fā)揮一系列生理作用，如基因表達(dá)、有絲分裂、增生、移動(dòng)和新陳代謝等[3]。P-ERK1/2再將其他各種各樣的底物，包括細(xì)胞膜蛋白、核蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及幾種MAPK激活蛋白激酶（MKs）等磷酸化促使神經(jīng)元胞體合成神經(jīng)再生所需要的各類蛋白增加，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生；而且P-ERK1/2能抑制caspase-9的活性，進(jìn)而抑制caspase-3，從而抑制凋亡[4]，推測坐骨神經(jīng)切斷1W時(shí)在各種因素的刺激下促進(jìn)軸突生長以及相關(guān)促進(jìn)生長的蛋白及因子的合成加快，并且降低了神經(jīng)元凋亡的發(fā)生；而在假手術(shù)組中并未發(fā)生明顯的變化，表明在未切斷坐骨神經(jīng)的手術(shù)過程中，并不會(huì)激活MAPK/ERK kinase途徑。在坐骨神經(jīng)切斷術(shù)后2W 時(shí)P-ERK1/2 的表達(dá)達(dá)到了高峰，表明P-ERK1/2在各種因素的刺激下，持續(xù)激活MAPK/ERK途徑并發(fā)揮作用，在此時(shí)期可能是有絲分裂加速最快、蛋白合成最多、軸突生長最快的時(shí)期；PERK1/2表達(dá)逐漸下調(diào)，表明基因表達(dá)、有絲分裂、增生、移動(dòng)和新陳代謝包括細(xì)胞膜蛋白、核蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等下調(diào)或降低[5]。

通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以推斷在坐骨神經(jīng)切斷術(shù)后4～8W時(shí)神經(jīng)元的再生能力會(huì)逐漸降低。各組間數(shù)據(jù)分析在1W～4W組中P-Erk1/2表達(dá)坐骨神經(jīng)切斷組明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其兩組中各時(shí)相表達(dá)結(jié)果與免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。說明坐骨神經(jīng)切斷后，MAPK/ERK1/2信號途徑在1W內(nèi)就已經(jīng)被激活而發(fā)揮調(diào)控作用。

神經(jīng)損傷后，再生信號立刻啟動(dòng)，雖然調(diào)控細(xì)胞凋亡的激活和抑制機(jī)制還未闡明，但通過本實(shí)驗(yàn)證明了周圍神經(jīng)損傷后確實(shí)出現(xiàn)P-ERK上調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡促進(jìn)軸突再生的作用。因此如果能研究出一種能持續(xù)調(diào)控MAPK/ERK1/2信號通路的方法,將有利于加強(qiáng)神經(jīng)元胞體的保護(hù),促進(jìn)神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)，在臨床應(yīng)用中具有重要意義[6]。

[1]Vicki Waetziga, Thomas Herdegen.The concerted signaling of ERK1/2 and JNKs is essential for PC12 cell neuritogenesis and converges at the level of target proteins[J].Molecular and Cellular Neuroscience,2003, 21(1):238-249.

[2]Colucci-D, Amato L, Perrone-Capano C, et al.Chronic activation of ERK and neurodegenerative diseases[J].Bioessays,2003,25(11):1085-1095.

[3]Philippe P，Roux and John Blenis，ERK and p38 MAPK-Activated Protein Kinases: a Family of Protein Kinases with Divers e Biological Functions[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2004,68(2).320-344.

[4]Allan L.A., Morrice N., Brady S., et al.Inhibition of caspase-9 through phosphorylation at Thr 125 by ERK MAPK[J].Nat.Cell.Biol 2003, 5(7):647-654.

[5]Michaela Moors, Jason E.Cline, Josef Abe, et al.ERK-dependent and -independent pathways trigger human neural progenitor cell migration[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2007, 221(1):57-67.

[6]朱春雷,吳廣志,徐明珠,等.大鼠坐骨神經(jīng)切斷術(shù)后在背根神經(jīng)節(jié)中P-Erk1/2表達(dá)和變化[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2009,13（3）：345-347.