王月圓，劉向敏，周明兵，湯定欽

（浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

生氰糖苷（cyanogenic glycosides）亦稱氰苷、氰醇苷，是由氰醇衍生物的羥基和D-葡萄糖縮合形成的糖苷，已在2650多種植物中發(fā)現(xiàn)，分屬于蕨類植物（蕨類）、裸子植物和被子植物（開花植物）的130個家族[1-2]。生氰糖苷的主要生物學功能在于阻止食草動物和病原體的對植物侵害。當生氰植物（本身含有生氰糖苷的植物）外部受損時，生氰糖苷將會產(chǎn)生有毒的氰化氫（HCN），從而阻止食草動物和病原體的進一步傷害[3]。生氰糖苷的生物合成過程比較簡單，一般包括3個步驟，催化生氰糖苷合成的酶主要是2種細胞色素P450，屬于CYP79家族和CYP71家族，另外還有一種葡萄糖轉(zhuǎn)移酶UGT85B1[4]。本研究首次在竹子中發(fā)現(xiàn)和鑒定到生氰糖苷合成的關鍵酶CYP79家族同源基因（DQ409175），表明在竹亞科Bambusoideae也可能存在生氰糖苷途徑，為研究竹類植物生氰糖苷的生物合成，人為控制生氰糖苷生物合成，從而干擾其毒性的產(chǎn)生，保證食筍的安全性奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TaqDNA聚合酶，三磷酸堿堿基脫氧核苷酸（dNTPs），Agarose Gel DNA Extraction Kit，PCR Product Extraction Kit等均為上海生工公司產(chǎn)品，大腸埃希菌Escherichia coli轉(zhuǎn)化的受體為大腸埃希菌DH5α菌株，克隆質(zhì)粒載體為pMD18-T。在浙江省臨安市太湖源觀賞竹種園采集小佛肚竹Bambusa ventricosa幼嫩的筍作為基因克隆的起始材料。

1.2 總RNA提取

采用Invitrogen公司的Trizol reagent提取小佛肚竹幼筍的核糖核酸（RNA），用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Su-perScriptTMFirst Strand Synthesis System for RT-PCR合成cDNA。

1.3 基因的克隆與序列分析

根據(jù)已知CYP79家族同源基因序列設計上游引物PF（5′-CCG TGG AAG GAG ACG CTG TCG-3′）和下游引物PR （5′-GGG GTC GCA GTG CGG ACC GGT GCC-3′），由上海生工生物工程有限公司合成。以小佛肚竹cDNA為模板，片段擴增溫度反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 40 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。聚合酶鏈式反應（PCR）產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α菌株，經(jīng)藍白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒并酶切圖譜分析后，再將單克隆送上海生工生物工程有限公司測序。

基因序列的3′端延伸和5′端延伸分別采用Invitrogen公司的3’RACE kit和TaKaRa公司的BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit。 3′-RACE 的 2 條特異引物分別為 P3-1：5′-GGC GAC CAG TGG AAG AAG ATG-3′和 P3-2： GCG GCT ACA AGA ACG CAG TT， 精簡的通用擴增引物（AUAP）： 5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3′。 5′-RACE 的特異引物分別為 P5-1： 5′-TTC ACC ATA GCC TCC TAC AGT CCA ACC AAA-3′， 通用套式引物（NUP）：AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT。

3′末端擴增反應條件同中間序列擴增一致，5′末端擴增反應條件為：94℃30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；70℃30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃30 s，68℃ 30 s，72℃3 min，27個循環(huán)。聚合酶鏈式反應（PCR）產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，送上海生工生物工程有限公司測序。根據(jù)中間擴增片段、3′末端擴增片段和5′末端擴增片段的序列利用Vector NTI Advance 9軟件拼接成全長序列。設計一對引物（CICR-5： CTGAAGGACTAGGAGACATCAGC和CICR3：GGGCACCATAGCC-TCCTACAG）一次性將全長序列擴增出來，克隆到pMD18-T載體后，測序驗證。利用DNASTAR和Clustl W等生物軟件分析測定cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點，并與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行Blast比較分析。

1.4 系統(tǒng)樹的構(gòu)建

采用鄰位相連法（neighbor-joining，N-J法）繪制系統(tǒng)樹，并對其進行自展（bootstrapvalue 1000）性評估；最后用TreeView軟件觀看、輸出圖形化的系統(tǒng)樹，每個類群出現(xiàn)的概率用百分數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小佛肚竹BvCYP79基因的克隆

以小佛肚竹cDNA為模板，上游引物（PF）和下游引物（PR）擴增出 400 bp左右有1條片段（圖1A），與預測的基因片段長度基本相符，初步確定為目的基因片段。

圖1 聚合酶鏈式反應（PCR）產(chǎn)物電泳檢測Figure1 Gel electrophoresis of amplification fragments of BvCYP79

測序結(jié)果表明：插入片段為379 bp。應用NCBI Blast在線軟件，將測序的序列與已報道的基因進行同源比較，發(fā)現(xiàn)編碼的氨基酸編碼序列含有CYP79蛋白家族的保守域，初步確認為擴增的部分基因序列來源于CYP79家族基因。

再次以小佛肚竹cDNA為模板，用特異引物P3-1，P3-2和精簡的通用擴增引物（AUAP）擴增出1411 bp左右的條帶，特異引物P5-1和通用套式引物（NUP）擴增出1102 bp左右的條帶（圖1B，C），經(jīng)測序后，與中間片段拼接得小佛肚竹CYP79家族基因的的全長cDNA，根據(jù)兩端序列設計相應的引物，進行全長序列擴增（圖1D），測序結(jié)果與拼接結(jié)果一致，遂命名為BvCYP79。該全長cDNA序列為1913 bp（圖2），翻譯起始點為193堿基處，終止子位于1752 bp，包含1個1559 bp的完整編碼區(qū)，開放閱讀框共編碼519個氨基酸（圖2）。

2.2 小佛肚竹BvCYP79氨基酸序列分析

應用ProtParam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）對上述推測的氨基酸序列進行分析。BvCYP79編碼蛋白質(zhì)的分子量（MW）58149.8D， 理論等電點（theoreticalPI）為 6.00， 分子式（formula）為C2594H4101N741O738S21。用PBIL Network Protein Sequence Analysis對基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)進行了分析，BvCYP79的二級結(jié)構(gòu)中41.43%為螺旋結(jié)構(gòu)（helices），5.78%為線狀結(jié)構(gòu)（strands），52.79%為卷曲結(jié)構(gòu)（coils），卷曲結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)是BvCYP79蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的骨架。

應用Blast進行氨基酸序列相似性比較，BvCYP79與大麥Hordeum vulgare的HvCYP79A8（ACJ70085），琴葉擬南芥 Arabidopsis lyrata的 AlCYP79B2（XP-002866896）以及擬南芥 A.thaliana的AtCYP79B2（NP-195705）的相似性最高，均達99%，其次為甘藍型油菜Brassica napus的BnCYP79B5（AF453287-1），相似性為98%，和甘藍B.oleracea的BoCyp79B1（ADW54459）相似性為97%，和楊毛果Populus trichocarpa的PtCYP79D8（XP-002305081）相似性為96%。上述蛋白質(zhì)序列都聚具有CYP79家族特有的PERH區(qū)域和與處在血紅素結(jié)合區(qū)的保守序列（S/T）F（S/T）TGRRGCXG。

2.3 小佛肚竹BvCYP79聚類分析

植物細胞色素P450家族（the cytochrome P450 superfamily）又稱之為CYP家族，其基因總數(shù)尚不清楚，至今已鑒定90多個植物P450基因，分屬于27個基因（CYP51，CYP71，CYP72，…，CYP96）[5]。選取34個與BvCYP79同源關系較近的P450基因的氨基酸與BvCYP79氨基酸序列做聚類分析，結(jié)果表明：BvCYP79與高粱Sorghum bicolor的SbCYP79A1進化關系最近，喻示著它們之間有類似的生物學功能（圖3）。高粱的SbCYP79A1是在生氰糖苷合成中首先被分離和鑒定的酶，是從高粱黃化苗的微粒體中分離出來[6]。在高粱黍蜀氰苷代謝過程中，CYP79A1，CYP71E1和UGT85B1作為一個聯(lián)合體共同起作用，在NADPH（細胞色素P450還原酶）的參與下，由氰醇衍生物的羥基和D-葡萄糖催化縮合形成的糖苷。BvCYP79基因在小佛肚竹的克隆和鑒定表明生氰糖苷途徑也可能存在于竹類植物。

圖2 小佛肚竹BvCYP79堿基序列和推測的氨基酸序列Figure2 Sequence of BvCYP79

圖3 小佛肚竹BvCYP79與34個植物P450基因的氨基酸序列采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)樹Figure3 Phylogenetic relationships of the translated BvCYP79 and 34 plant cytochrome P450 protein sequences collected in databanks

3 討論

生氰糖苷在2000多種植物中發(fā)現(xiàn)，分布于蕨類植物、裸子植物和被子植物。生氰的蕨類植物和裸子植物含有芳香族生氰糖苷，源自酪氨酸或苯丙氨酸，而被子植物含有脂肪族以及芳香族生氰糖苷分別來自于異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或酪氨酸、苯丙氨酸。另外，一些植物如西番蓮Passiflora caerulea含有生氰糖苷來自蛋白氨基酸環(huán)戊烯甘氨酸。當含有生氰糖苷的植物組織受損害時，生氰糖苷將被β-糖苷酶和α-羥氰酶降解，釋放出有毒的氰化氫以及葡萄糖和醛或酮，使植物對草食動物和病原體造成的組織損傷進行即時的化學防御反應[7-8]；轉(zhuǎn)基因植物也可以容納其他植物的生氰糖苷合成途徑，積累產(chǎn)生生氰糖苷，達到阻止特殊昆蟲危害的目的。如在轉(zhuǎn)基因擬南芥異源表達3個高粱基因的研究中，發(fā)現(xiàn)專食十字花科Cruciferae植物的跳蚤甲蟲不吃含有黍蜀氰苷的擬南芥。這清楚地顯示代謝工程在生產(chǎn)所需特性的農(nóng)作物方面的潛力[9]。小佛肚竹是優(yōu)良的觀賞竹類，在園林觀賞上具有廣泛的應用前景，調(diào)查BvCYP79功能，為增強小佛肚竹的病害防御功能及通過基因工程手段調(diào)控小佛肚竹生氰糖苷生物合成奠定了基礎。

生氰糖苷在分子水平上的進化信息，目前在植物中只限于CYP79家族。從植物中選定71個CYP79家族成員進行系統(tǒng)發(fā)育重建工作，表明CYP79家族在被子植物和裸子植物分化前（3億年前）起源于共同祖先，反映了生氰糖苷的古老性[10]。本研究利用小佛肚竹BvCYP79和34個植物P450基因的氨基酸的聚類分析結(jié)果也表明P450基因應該起源的共同祖先，并在單子葉植物和雙子植物分化之前就開始了功能的歧化。

與其他家族的植物色素P450相比，CYP79家族的特點是一般具有保守的“PERF”和血紅素結(jié)合域[11]。在單子葉植物CYP79家族的PERF區(qū)域，保守的非極性的和芳香族的苯丙氨酸殘基被帶正電荷的氨基酸殘基組氨酸所取代而使單子葉植物CYP79家族保持著PERH區(qū)域。同樣，在血紅素結(jié)合區(qū)保守序列PFGXGRRXCXG，疏水性氨基酸用極性的絲氨酸或蘇氨酸殘基進行3種替換，提供了單子葉植物CYP79家族相應保守序列為（S/T）F（S/T）TGRRGCIA[6，12]， 小佛肚竹 BvCYP71 的編碼氨基酸在上述 2 個保守域分別為PERF和SFSTGRRGCIA，屬于典型的單子葉植物CYP79家族基因（圖3）。本課題計劃通過原核和真核表達分析BvCYP71催化功能，探討生氰糖苷對小佛肚竹生長發(fā)育的影響。

[1]CONN E E.Cyanogenic glycosides [J].Biochem Plants， 1981， 7： 479-500.

[2]SIEGLER D S， BRINKER A M.Characterisation of cyanogenic glycosides， cyanolipids， nitroglycosides， organic nitro compounds and nitrile glycosides from plants [G]//DEY P M， HARBORNE J B.Methods of Plant Biochemistry，Alkaloids and Sulfur Compounds.New York： Academic Press， 1993： 51-93.

[3]WINKEL B S J.Metabolic channeling in plants [J].Annu Rev Plant Biol， 2004， 55： 85-107.

[4]HANSEN K S， KRISTENSEN C， TATTERSALL D B， et al.The in vitro substrate regiospecificity of recombinant UGT85B1， the cyano-hydrin glucosyltransferase from Sorghum bicolor[J].Phytochemistry， 2003， 64： 143-151.

[5]MORANT M， BAK S， M?LLER B L， et al.Plant cytochromes P450： tools for pharmacology， plant protection and phytoremediation [J].Curr Opin Biotechnol， 2003， 14： 151-162.

[6]BAK S， KAHN R A， NIELSEN H L， et al.Cloning of three A-type cytochromes P450， CYP71E1， CYP98， and CYP99 from Sorghum bicolor （L.） Moench by a PCR approach and identification by expression in Escherichia coli of CYP71E1 as a multifunctional cytochrome P450 in the biosynthesis of the cyanogenic glucoside dhurrin [J].Plant Mol Biol，1998， 36： 393-405.

[7]JONES P R， ANDERSEN M D， NIELSEN J S， et al.The biosynthesis， degradation， transport and possible function of cyanogenic glucosides [G]//ROMEO J T， IBRAHIM R， VARIN L， et al.Evolution of Metabolic Pathways.New York： Elsevier Science， 2000： 191-247.

[8]TATTERSALL D B， BAK S， JONES P R， et al.Resistance to an herbivore through engineered cyanogenic glucoside synthesis [J].Science， 2001， 293： 1826-1828.

[9]MORANT A V， J?RGENSEN K， J?RGENSEN B， et al.Lessons learned from metabolic engineering of cyanogenic glucosides [J].Metabolomics， 2007， 3： 383-398.

[10]BAK S， PAQUETTE S， MORANT M， et al.Cyanogenic glycosides： a case study for evolution and application of cytochromes P450 [J].Phytochem Rev， 2006， 5： 309-329.

[11]WERCK-REICHHART D， BAK S， PAQUETTE S.Cytochrome P450 [R]//SOMERVILLE C R， MEYEROWITZ E M.The Arabidopsis Book.Rockville： American Society of Plant Biologists， 2002.

[12]ANDERSEN M D， BUSK P K， SVENDSEN I， et al.Cytochromes P-450 from cassava （Manihot esculenta Crantz）catalyzing the first steps in the biosynthesis of the cyanogenic glucosides linamarin and lotaustralin： cloning， functional expression in Pichia pastoris， and substrate specificity of the isolated recombinant enzymes [J].J Biol Chem， 2000，275：1966-1975.