張 禹 潘樹義 李 航 楊 晨 潘曉雯

海軍總醫(yī)院高壓氧科，北京 100048

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）是一種小分子二聚體蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)生長(zhǎng)因子相關(guān)，主要由腦組織合成，在腦內(nèi)主要分布在大腦和海馬，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種類型神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、維護(hù)和再生都具有顯著作用[1]。創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）致死率、致殘率高，治療方法有限，近年來國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)生逐步開始應(yīng)用高壓氧（HBO）治療TBI患者，并取得了一定療效，但其治療機(jī)制尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)研究了HBO對(duì)側(cè)位液壓沖擊腦損傷大鼠腦內(nèi)皮層及海馬區(qū)BNDF表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明HBO在增強(qiáng)腦內(nèi)BDNF表達(dá)方面的機(jī)制，并對(duì)腦創(chuàng)傷后開始HBO治療的時(shí)間及療程進(jìn)行初步探討，為臨床更好地應(yīng)用HBO治療TBI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

BDNF兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；HPD-1700型液壓撞擊儀及TDS1002數(shù)字存儲(chǔ)示波器，由美國(guó)DRAGONFLY研究與發(fā)展公司生產(chǎn)；DWC150-300型透明純氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙，由上海701所楊園醫(yī)用氧艙廠制造；韓國(guó)生產(chǎn)微型牙科磨鉆；醫(yī)用液態(tài)純氧由北京普萊克斯實(shí)用氣體有限公司提供。

1.2 動(dòng)物模型的建立

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將腦損傷組及正常對(duì)照組大鼠各組內(nèi)再隨機(jī)分成兩組，即高壓氧組和常壓對(duì)照組，每組8只。腦創(chuàng)傷高壓氧組及高壓氧對(duì)照組于造模后24 h進(jìn)行HBO治療，具體方法為將氧

健康雄性 Wistar大鼠 32 只，體質(zhì)量（250±10）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)為SCXK-（軍）2007-004。將大鼠隨機(jī)分為腦損傷組和正常對(duì)照組，每組16只。腦損傷組大鼠采用液壓沖擊硬腦膜的方式建立模型。麻醉方法為經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（劑量0.3 mL/100 g），3 min后將大鼠俯臥位四肢固定，剪去頭部鼠毛局部消毒，切開左顱頂皮膚分層剝離軟組織，止血鉗固定后充分暴露顱骨，用微型牙科磨鉆行顱骨鉆孔至硬腦膜，孔徑2 mm，位于冠狀縫和矢狀縫左下3 mm處，暴露硬腦膜并保持完整。調(diào)試液壓撞擊儀的重錘高度，將液壓沖擊力度調(diào)整為0.3 mPa，即TDS1002示波器上顯示為波峰為1.5 V的正弦波，液壓沖擊管連接大鼠鉆孔處，連續(xù)3次液壓沖擊硬腦膜，造成重型閉合性顱腦損傷。完成后縫合皮膚，待麻醉復(fù)蘇后放置籠中飼養(yǎng)。正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。氣瓶連接動(dòng)物艙，將大鼠置于艙內(nèi)，關(guān)閉艙門，常壓下打開進(jìn)氣閥及排氣閥，使用純氧洗艙5min后開始純氧加壓，加壓時(shí)間5 min，加至 2.5 ATA（1 ATA=0.1 mPa）開始穩(wěn)壓吸氧 45 min，穩(wěn)壓時(shí)維持氧流量在1 L/min，保持艙內(nèi)氧濃度在95%，減壓時(shí)間10 min。連續(xù)HBO治療5 d，每日1次。腦損傷常壓空氣組及常壓空氣對(duì)照組大鼠于常壓室內(nèi)籠中飼養(yǎng)。

1.4 BDNF免疫組化檢測(cè)

各組大鼠在完成HBO治療后，用10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注固定。斷頭取腦，于損傷處冠狀切取腦組織塊，對(duì)照組大鼠同樣位置切取。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度5μm），行常規(guī)HE染色。采用常規(guī)SP法組織化學(xué)染色，脫蠟，水化組織切片，滴加BDNF多克隆抗體（1∶200），PBS溶液沖洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，復(fù)染，脫水，封片。光鏡下胞漿或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，分別于皮層區(qū)及海馬區(qū)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，光鏡下（×200）隨機(jī)選擇 5個(gè)視野，取平均值，以“個(gè)/視野”來表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦表面挫裂傷情況及損傷腦組織HE染色

肉眼觀腦創(chuàng)傷組大鼠腦表面溝回積血，局部硬膜下出血、腦實(shí)質(zhì)出血及腦挫裂傷。HE染色后，光鏡下正常對(duì)照組大鼠大腦皮層及海馬區(qū)各部位結(jié)構(gòu)及細(xì)胞層次清楚，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，核膜完整，核仁清楚；腦損傷組皮層區(qū)及海馬組織結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞腫脹，核膜、核仁不清，部分變性壞死細(xì)胞皺縮變圓，與鄰近細(xì)胞脫離接觸，核固縮變圓，胞漿深染（圖 1、2）。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

光鏡下BDNF免疫陽性細(xì)胞表現(xiàn)為神經(jīng)元胞漿內(nèi)呈現(xiàn)廣泛分布的棕黃色小顆粒，胞核部分棕黃色著色（圖3、4）。大腦皮層區(qū)BDNF免疫陽性細(xì)胞數(shù)見表1，海馬區(qū)BDNF免疫陽性細(xì)胞數(shù)見表2。

3 討論

BDNF是一種具有防止神經(jīng)元死亡功能的蛋白質(zhì)，主要由腦組織合成，在腦內(nèi)主要分布在海馬和皮層區(qū)域。在腦損傷后可以為受損神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)其存活和修復(fù)，并直接促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)；BDNF通過與其特異的功能受體TrkB的相互結(jié)合和作用，阻斷胞內(nèi)損傷因子對(duì)蛋白激酶C的失活，以防止神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死；還可通過影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的活性來保護(hù)受損神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激的進(jìn)一步損害；BDNF可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗興奮性氨基酸毒性損傷的能力，防止腦損傷后谷氨酸持續(xù)釋放而引起的鈣超載，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、修復(fù)方面發(fā)揮著重要的作用[2-4]。但外源性BDNF不易透過血腦屏障，靜脈注射對(duì)損傷腦組織無明顯保護(hù)作用，因此，提高內(nèi)源性BDNF的表達(dá)對(duì)腦損傷后促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)尤為重要。

腦損傷后維持神經(jīng)細(xì)胞正常代謝所必需的微血管系統(tǒng)也同樣遭到破壞，難以保證組織得到有效氧供。HBO治療可迅速提高機(jī)體肺泡氣中的氧分壓，從而提高血氧含量，使氧在組織的中彌散半徑增大，容易彌散到深部受損腦組織，利于神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。近年來臨床應(yīng)用HBO治療TBI患者逐步增多，目前研究發(fā)現(xiàn)的HBO腦保護(hù)機(jī)制主要包括：①改善腦血流，降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫。HBO通過高分壓氧刺激血管平滑肌收縮，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO減少，減少腦組織的CO2，可以使頸動(dòng)脈系統(tǒng)的血管收縮，阻力增加，腦血流量減少，達(dá)到降低顱內(nèi)壓減輕腦水腫的作用。同時(shí)HBO可促進(jìn)椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)血流量增加，在2.0 ATA環(huán)境下吸純氧即可使椎動(dòng)脈血流量增加18%。②糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒，減輕鈣超載。由于氧供改善，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)糖的無氧酵解終止，有機(jī)酸產(chǎn)生停止，蓄積的有機(jī)酸重新進(jìn)入三羧酸循環(huán)繼續(xù)氧化，從而糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒。HBO可以改善細(xì)胞生物膜通透性，Ca2+泵啟動(dòng)，將胞漿內(nèi)多余的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外和肌漿網(wǎng)，肌漿網(wǎng)攝取、儲(chǔ)存Ca2+恢復(fù)，使細(xì)胞內(nèi)鈣超載改善。③可抑制趨化因子、黏附因子、細(xì)胞因子的表達(dá)，減少TXA2等活性物質(zhì)的生成，減輕炎性損傷。④阻止神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡。HBO可減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，改善線粒體膜通透性，恢復(fù)線粒體跨膜電位，還可通過多方面調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因，可抑制腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，有利于促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[5-9]。但這些理論還不能完全闡明HBO的治療機(jī)制。

表1 大腦皮層區(qū)BDNF免疫陽性細(xì)胞數(shù)（x±s，個(gè)/視野，n=16）

表2 海馬區(qū)BDNF免疫陽性細(xì)胞數(shù)（x±s，個(gè)/視野，n=16）

本研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷HBO組皮層及海馬BDNF免疫陽性細(xì)胞數(shù)量均多于腦損傷常壓空氣組及正常對(duì)照組，提示HBO治療可通過促進(jìn)腦內(nèi)BDNF的生成從而促進(jìn)腦損傷后肢體運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)和記憶能力的恢復(fù)。研究還發(fā)現(xiàn)HBO對(duì)正常大鼠皮層及海馬BDNF的表達(dá)無增強(qiáng)作用，腦損傷后大鼠的BDNF表達(dá)有一定增強(qiáng)，但作用有限。腦損傷急性期腦內(nèi)去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺釋放增加，可激活腦內(nèi)cAMP依賴的蛋白激酶。BDNF的表達(dá)受控于cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），BDNF基因含有CRE序列，是CREB的靶基因，從而促進(jìn)BDNF的表達(dá)，隨著5-羥色胺等分泌的減少其表達(dá)也逐步減弱。HBO治療腦損傷時(shí)腦內(nèi)有氧代謝旺盛，ATP生成增加，加之交感神經(jīng)興奮，刺激β-腎上腺素能受體，激活腺苷環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)ATP形成更多的cAMP，CREB與BDNF基因CRE序列的結(jié)合增加，增強(qiáng)了BNDF基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)腦損傷大鼠皮層及海馬的BDNF表達(dá)[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，腦外傷后24 h內(nèi)大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，之后逐漸減少，提示創(chuàng)傷后的自我保護(hù)機(jī)制逐步下降[11]。在不同時(shí)間腦室內(nèi)注射BDNF，對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷有不同程度的保護(hù)作用，時(shí)間越早保護(hù)作用越明顯，此作用可能與BDNF能夠增加體內(nèi)SOD的活性并抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)[12]。本研究HBO治療開始時(shí)間為創(chuàng)傷后24 h，連續(xù)治療5 d，通過早期HBO來促進(jìn)腦內(nèi)BNDF的生成，從而彌補(bǔ)創(chuàng)傷應(yīng)激后腦內(nèi)BDNF表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短的不足，起到腦保護(hù)作用，為臨床治療方案的選擇提供思路。

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