劉 瑛 王斌全 高 偉 張春明 張海利 馮 彥 陳鋼鋼 溫樹信 皇甫輝

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，山西太原 030001

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞的生長與分化，參與惡性腫瘤進(jìn)展，已成為近年來惡性腫瘤治療的熱點[1]。βcatenin為wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵分子，在癌細(xì)胞中其表達(dá)增高，從胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中，使該通路活化，從而使癌細(xì)胞進(jìn)一步增殖、分化[2]。cyclinD1為wnt/β-catenin通路的下游關(guān)鍵基因[3]，通過檢測其表達(dá)可以反映是否開啟wnt/β-catenin通路的情況。Mucin1為分泌性糖蛋白，已有文獻(xiàn)報道其可調(diào)控β-catenin在胞漿的表達(dá)，從而影響wnt/β-catenin通路[4]。目前Mucin1、β-catenin、cyclinD1三者聯(lián)合在喉鱗狀細(xì)胞癌上的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報道，故本實驗在喉鱗狀細(xì)胞癌與對照組的石蠟包埋組織標(biāo)本中檢測Mucin1與Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩種關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況，旨在從生子生物學(xué)角度了解三者之間臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，研究其在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本實驗選用2000年1月～2008年12月山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院168例喉鱗狀細(xì)胞癌患者與53例正常癌旁組織的石蠟切片，男159例，女9例，平均年齡61歲。按腫瘤發(fā)生部位分期：聲門上型61例，跨聲門型10例，聲門型91例，聲門下型為6例。按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（UICC，2010年）：T1期42例，T2期33例，T3期72例，T4期21例。病理學(xué)分期：低分化25例，中分化108例，高分化35例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移133例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。

1.2 免疫組織化學(xué)法（S-P 法）

嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)的步驟操作。簡述如下：首先將石蠟切片經(jīng)65℃～68℃烤箱內(nèi)脫蠟3 h后進(jìn)行梯度水化（100%、90%、80%、70%）各 3 min，PBS清洗后將 Mucin1、βcatenin用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，cyclinD1則用EDTA修復(fù)，再經(jīng)3%過氧化氫封閉、正常山羊血清封閉液封閉后，加入一抗（Mucin1、cyclinD1 稀釋倍數(shù)分別為 1∶500、1∶50，β-catenin為即用型抗體）后放入4℃冰箱過夜。第2天將組織切片復(fù)溫1 h后加入二抗，經(jīng)DAB顯色、蘇木素染色、中性樹膠封片，最后放顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗，用已知陽性組織切片進(jìn)行對照?？贵w選用：C595（NCRC48）MSmAb to Mucin1（ab8081，abcam）、MAB-0259 鼠抗人β-聯(lián)蛋白免疫組化單克隆抗體、KIT-5010快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物、RMA-0541兔抗人周期素D1免疫組化單克隆抗體、DAB顯色盒均購于福州邁新公司。

1.3 陽性評分標(biāo)準(zhǔn)

Mucin1參考Jeannon等[5]的方法，以癌細(xì)胞胞質(zhì)中被染成棕黃色為陽性表達(dá)，0分為無陽性表達(dá)，1分為≤50%的弱陽性表達(dá)；2分為＞50%的強陽性表達(dá)。β-catenin參考Maruyama評判方法[6]在癌組織的胞膜上陽性率＞70%視為正常，反之為表達(dá)減弱；而胞質(zhì)/胞核陽性率＞10%視為異位表達(dá)。cyclinD1的評判標(biāo)準(zhǔn)參照Morshed等[7]，即胞核有棕黃色顆粒沉積為陽性表達(dá)，＞5%記為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件做 χ2檢驗、Spearman秩相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mucin1、β-catenin與cyclinD1在喉鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)

免疫組織化學(xué)S-P法染色結(jié)果顯示，在喉鱗癌中Mucin1、β-catenin均為胞質(zhì)呈棕黃色，cyclinD1為胞核棕黃色，并采用χ2檢驗分別在喉鱗癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示 Mucin1在癌組織的陽性率為52.38%（χ2=20.502，P ＜ 0.01），β-catenin 的異位表達(dá)率為 67.86%（χ2=62.560，P ＜ 0.01），cyclinD1在癌組織的陽性率為 85.12%（χ2=118.158，P＜0.01）三者均在喉鱗癌組織中表達(dá)高于癌旁正常組織，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 Mucin1、β-catenin與cyclinD1三者的相關(guān)分析

喉鱗胞癌組織中Mucin1有88例為陽性表達(dá)，同時有70例β-catenin陽性表達(dá)，78例 cyclinD1陽性表達(dá)，即隨著Mucin1表達(dá)的增強，β-catenin與cyclinD1的陽性表達(dá)率也增高。進(jìn)一步經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示：Mucin1與β-catenin 呈正相關(guān) （r=0.763，P=0.003），β-catenin 和 cyclinD1呈正相關(guān) （r=0.431，P=0.021）。 而 Mucin1和 cyclinD1 之間無統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.016，P=0.138）。

3 討論

wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是參與細(xì)胞生長與發(fā)育的經(jīng)典途徑之一[1]，若其傳導(dǎo)障礙則引起細(xì)胞生長、分化異常，從而引發(fā)腫瘤的形成。β-catenin是wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白，其濃度決定是否開啟wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。正常情況下，β-catenin主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，而在胞漿中被降解，故在胞漿與胞核表達(dá)較少。在腫瘤細(xì)胞中，β-catenin不能被磷酸化，在胞漿的含量增多，甚至在胞核表達(dá)，激活了wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞不斷增殖、分化，最終引發(fā)腫瘤。在本次研究中，β-catenin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中為胞漿異位表達(dá)，異位表達(dá)率為67.86%，而癌旁正常組織幾乎無異位表達(dá)。這與黃種心等[8]報道的β-catenin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中有明顯的異位表達(dá)結(jié)論一致。國外也有相同報道，Goulioumis等[9]認(rèn)為β-catenin在聲門上喉鱗狀細(xì)胞癌存在異常表達(dá)。

正常細(xì)胞增殖周期分為間期與分裂期，其中間期為3個階段，包括G1期的DNA合成前期、S期的DNA合成期與G2期的DNA合成后期。cyclinD1為細(xì)胞周期素D1，為控制G1期到S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子之一。已有文獻(xiàn)報道cyclinD1為癌基因，正常在胞膜上無或極少量表達(dá)而在癌細(xì)胞中表達(dá)增多，其生物學(xué)作用為調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期從而控制細(xì)胞的增殖速度[10]。cyclinD1可作為wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要下游基因，通過其可判斷是否開啟了wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。當(dāng)β-catenin在胞漿內(nèi)堆積，甚至進(jìn)入細(xì)胞核，激活cyclinD1控制細(xì)胞G1到S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。結(jié)合本次研究中cyclinD1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)增高（陽性率為85.12%），染色結(jié)果表現(xiàn)為胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒樣物，而在癌旁正常組織的無陽性表達(dá)。與Pignataro等[11]認(rèn)為cyclinD1在喉鱗狀細(xì)胞癌過度表達(dá)的觀點相同。

Mucin1為分泌性糖蛋白，主要功能為參與細(xì)胞的粘附。Schroeder等[12]報道 Mucin1可直接控制β-catenin的濃度，從而調(diào)控wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在本次研究中，Mucin1在癌組織胞質(zhì)成棕黃色，且陽性率為52.38%（χ2=20.502，P＜0.01）。Mucin1在喉鱗狀細(xì)胞癌的研究尚無國內(nèi)文獻(xiàn)報道。本次研究還發(fā)現(xiàn)Mucin1、β-catenin與cyclinD1之間呈正相關(guān)，這與Prasad等[13]報道的β-catenin與cyclinD1在乳腺癌表達(dá)呈正相關(guān)的結(jié)論相符。而三者結(jié)合起來在喉鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)相關(guān)性尚無文獻(xiàn)報道，為進(jìn)一步研究喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展提供新思路。

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表1 Mucin1、β-catenin和cyclinD1在喉鱗狀細(xì)胞癌與癌旁組織中的陽性表達(dá)情況（例）

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