武俊瑞，李 欣，張 苗，李曉忱，楊臣辰，岳喜慶

自然發(fā)酵酸菜汁中乳桿菌的分離鑒定

武俊瑞，李 欣，張 苗，李曉忱，楊臣辰，岳喜慶*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

通過(guò)選擇性培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察，從分別采自遼寧省阜新、葫蘆島、興城、營(yíng)口、錦州的5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中，分離純化和篩選出4株具有耐酸特性的乳桿菌疑似菌株(HLD1-3、YK1-2、JZ6-3、XC4-4)，并對(duì)其進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性、過(guò)氧化氫酶、石蕊牛乳、明膠液化、不同溫度生長(zhǎng)、不同NaCl質(zhì)量濃度生長(zhǎng)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，進(jìn)一步鑒定其屬種。二者結(jié)果均表明:4株耐酸乳酸菌均屬于乳桿菌屬，其中，HLD1-3和YK1-2屬于乳桿菌屬的清酒乳桿菌種，而JZ6-3和XC4-4屬于乳桿菌屬的植物乳桿菌種。由此可以推斷，東北自然發(fā)酵酸菜可作為潛在益生乳酸菌分離篩選的資源庫(kù)。

酸菜；耐酸；乳桿菌；分離鑒定

酸菜是將新鮮蔬菜經(jīng)乳酸菌發(fā)酵等一系列的加工方法賦予其一定酸味口感和香氣的發(fā)酵制品，有著悠久的制作和食用歷史。自然發(fā)酵酸菜以酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、解膩開(kāi)胃、增進(jìn)食欲等特點(diǎn)和功效深受人們的喜好，在我國(guó)，東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜聞名遐邇[1-2]。其中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源，近年來(lái)受到了食品行業(yè)的廣泛關(guān)注[1-4]。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)選擇性培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察，從采自遼寧省阜新、葫蘆島、興城、營(yíng)口、錦州等地的5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中，分離純化和篩選出4株具有耐酸特性的乳桿菌疑似菌株，并對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，進(jìn)一步鑒定其屬種，為進(jìn)一步進(jìn)行深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自阜新、葫蘆島、興城、營(yíng)口和錦州農(nóng)家自制傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁樣品各1份，共5份。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 上海桑尼生物科技有限公司；革蘭氏染色液、過(guò)氧化氫、葡萄糖、瓊脂、石蕊、明膠等。

1.2 儀器與設(shè)備

2720型Thermal cycler PCR儀、3730-XL型測(cè)序儀美國(guó)ABI公司；5804R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng) 中國(guó)天能公司；ZMB-300E顯微鏡 上海宙山精密光學(xué)儀器有限公司；TGL-16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱手提式高壓殺菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 采樣

在遼寧省阜新、葫蘆島、興城、營(yíng)口、錦州等地的農(nóng)家，采集采用傳統(tǒng)方法發(fā)酵的酸菜汁250mL，同時(shí)測(cè)定樣品pH值和溫度，并記錄發(fā)酵過(guò)程及時(shí)間等信息，置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于－60℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品的分離純化

采用傾注培養(yǎng)法，對(duì)樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離純化。吸取1mL酸菜汁樣品，接種于20mL添加了CaCO3的滅菌MRS固體培養(yǎng)基中，滅菌后MRS固體培養(yǎng)基在接種前要提前降溫至55℃并保持恒定，待瓊脂冷卻凝固后，放入?yún)捬醢l(fā)生器中，于30℃培養(yǎng)24～48h。挑取有Ca圈并且直徑在1～2mm的單菌落，在滅菌后MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離，于30℃培養(yǎng)24～48h，如此反復(fù)劃線分離2～3次，直到確定為單菌落后編號(hào)，分別于10倍放大鏡下進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)觀察，再挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，于100倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行菌體形態(tài)學(xué)觀察，并記錄。

1.3.3 耐酸菌株的初步篩選[5-6]

分別將分離純化的12株待測(cè)菌株接種于pH值為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，能夠生長(zhǎng)的初步判定為耐酸菌株。

1.3.4 生理生化鑒定[7-9]

1.3.4.1 過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，涂抹于已滴有15g/100mL H2O2的干凈載玻片上，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生，如無(wú)氣泡產(chǎn)生即為H2O2酶陰性反應(yīng)。

1.3.4.2 葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)

將耐酸菌株分別用接種于裝有倒置杜氏小管的PYG液體培養(yǎng)基中，于37℃的恒溫條件下培養(yǎng)24～48h，每天用肉眼觀察杜氏小管中有無(wú)氣泡產(chǎn)生，如果有氣泡產(chǎn)生則判定菌株為異型發(fā)酵陽(yáng)性反應(yīng)。

1.3.4.3 運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)

將耐酸菌株分別用接種針穿刺接種于MRS半固體培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對(duì)照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌落分布狀況，如果只是沿穿刺線生長(zhǎng)，而不向外擴(kuò)散，則判定該菌株無(wú)運(yùn)動(dòng)性，反之則判定為有運(yùn)動(dòng)性。

1.3.4.4 石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)

向脫脂牛奶中加入40mL質(zhì)量濃度為25g/L的石蕊，混合均勻后分裝試管，115℃高壓蒸汽滅菌7min。最后在37℃培養(yǎng)24～48h，觀察石蕊牛乳的凝固反應(yīng)。

1.3.4.5 明膠液化實(shí)驗(yàn)

將供試菌株接種于滅菌的明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對(duì)照，于37℃培養(yǎng)24～48h，在低溫條件下觀察結(jié)果。當(dāng)對(duì)照管凝固、接種管液化時(shí)，為陽(yáng)性。

1.3.4.6 不同溫度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

將供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對(duì)照，分別置于15℃和45℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.3.4.7 不同NaCl質(zhì)量濃度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

將供試菌株接種于滅菌的且分別含有4、6.5、15g/100mL的NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種試管作空白對(duì)照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.3.4.8 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將供試菌株分別接種于含葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、半乳糖和海藻糖的PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別以不接種的作空白對(duì)照，于37℃培養(yǎng)24～48h，觀察各試管顏色是否變黃。

1.3.4.9 利用16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定[10-13]

總DNA的提取及純度的檢測(cè):采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA。使用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度以及OD260nm/OD280nm比值，再用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

16S rDNA 序列的PCR擴(kuò)增:16S rDNA擴(kuò)增引物:采用細(xì)菌通用引物，正向引物為27f(對(duì)應(yīng)于Escherichia coli 8～27位堿基):5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1495r(對(duì)應(yīng)于Escherichia coli 1495～1515位堿基):5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL):上下游引物各1μL (10pmol/μL)，模板DNA (100ng/μL) 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP MIX 2μL，超純水17.2μL，rTaq酶0.3μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)30次；72℃延伸10min，4℃保溫。

檢測(cè)16S rDNA 擴(kuò)增片段:擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

16S rDNA 序列測(cè)定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù):供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成。得到的序列運(yùn)用Clust X軟件校準(zhǔn) 排齊后，在GenBank/ EMBL/DDBJ 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源性比對(duì)分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類。然后再對(duì)待測(cè)菌株與模式菌株16S rDNA序列利用程序MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步進(jìn)行種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集

表1 樣品采集情況Table 1 Information about pickle samples collected from 5 different regions

由表1可知，采集的5份樣品采集時(shí)的地點(diǎn)、溫度、pH值和發(fā)酵時(shí)間各不相同，樣品溫度在1.5～14.5℃之間，差異較大。樣品pH值在3.8～5.8之間，屬于偏酸性，發(fā)酵時(shí)間在70～120d之間，腌制的時(shí)間也不完全相同。

2.2 乳酸菌的分離及耐酸菌株初步篩選

通過(guò)選擇性培養(yǎng)和菌落及菌體形態(tài)學(xué)觀察，從5份自然發(fā)酵的酸菜汁中共分離得到12株革蘭氏染色陽(yáng)性的乳酸菌疑似菌株。進(jìn)一步通過(guò)觀察12株乳酸菌疑似菌株在pH值為3.0的MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，初步判定其是否耐酸，結(jié)果如表2所示。

表2 各菌株在pH值為3.0條件下的生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of 12 suspected Lactobacillus strains at pH 3.0

表3 供試菌株部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 4 screened strains

由表2可知，在pH值為3.0的MRS培養(yǎng)基中，只有菌株HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3能夠生長(zhǎng)，其余菌株均不能生長(zhǎng)，因此可以初步推斷出HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3等4株菌對(duì)酸性環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性。

2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3這4株具有耐酸特性菌株，分別進(jìn)行過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、不同溫度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、不同NaCl質(zhì)量質(zhì)量濃度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等生理生化鑒定，結(jié)果如見(jiàn)3、4。由表3可知，4株菌均表現(xiàn)為過(guò)氧化氫酶陰性，可初步判斷為乳酸菌，且葡萄糖產(chǎn)氣陰性，可排除異型發(fā)酵乳酸菌，其他特性分別為:運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)陰性、明膠液化實(shí)驗(yàn)陰性、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、在45℃生長(zhǎng)良好、15℃條件下不能生長(zhǎng)、在含15g/100mL NaCl的MRS培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)、在NaCl質(zhì)量濃度為4g/100mL時(shí)能正常生長(zhǎng)，其中XC4-4和JZ6-3兩株菌株在NaCl質(zhì)量濃度為6.5g/100mL時(shí)仍然能夠生長(zhǎng)。

表4 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of carbohydrate fermentation tests for 4 screened strains

由表4可知，XC4-4和JZ6-3均能利用選用的所有碳源；而HLD1-3和YK1-2則均不能利用甘露醇。

綜合以上生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology》[8]、《乳酸菌——生物學(xué)基礎(chǔ)及試驗(yàn)方法》[9]，4株菌均為乳桿菌，其中，XC4-4和JZ6-3符合文獻(xiàn)中描述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的特征，而HLD1-3和YK1-2則符合文獻(xiàn)中描述清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)。

2.4 利用16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，溴乙錠染色觀察發(fā)現(xiàn)在1500bp處有熒光條帶。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定，4株乳桿菌XC4-4、JZ6-3、HLD1-3和YK1-2的16S rDNA基因序列，長(zhǎng)度分別為1447、1443、1450bp和1444bp。

利用BLAST軟件，將菌株的16S rDNA序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，菌株XC4-4和JZ6-3的16S rDNA序列與植物乳桿菌的16S rRNA/rDNA序列相似性為100%，菌株HLD1-3和YK1-2與清酒乳桿菌的同源性為100%。利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖1所示。菌株XC4-4和JZ6-3與植物乳桿菌的系統(tǒng)位置最接近，菌株HLD1-3和YK1-2則與清酒乳桿菌的系統(tǒng)位置最近，與干酪乳桿菌、短乳桿菌、開(kāi)菲爾乳桿菌等在同一分支，同屬于高溫型乳酸菌，與嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌形成的同源簇有明顯差異。綜上，4株耐酸菌株均屬于乳桿菌屬，其中JZ6-3和XC4-4鑒定為乳桿菌屬的植物乳桿菌種，HLD1-3和YK1-2則為乳桿菌屬的清酒乳桿菌種。

圖1 利用16S rDNA序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

3 結(jié) 論

近年來(lái)，一些針對(duì)酸菜中乳酸菌的研究也日趨成熟。張魯冀[1]、張楊[13]等從自然發(fā)酵酸菜汁中分離出10株乳桿菌，分別鑒定為短乳桿菌4株、植物乳桿菌3株、棒狀乳桿菌1株、干酪乳桿菌1株和米酒乳桿菌1株。部分學(xué)者[2,13-16]則從自然發(fā)酵的酸菜汁中分離出3株高產(chǎn)酸菌株，分別鑒定為腸膜明串珠菌、短乳桿菌和植物乳酸桿菌，結(jié)果顯示，植物乳桿菌可能是發(fā)酵酸菜的優(yōu)勢(shì)菌種，而從發(fā)酵酸菜汁中分離純化清酒乳桿菌目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。本研究從遼寧5個(gè)地區(qū)采集的5份傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中分離純化出12株乳酸菌疑似菌株，篩選出YK1-2、HLD1-3、XC4-4和JZ6-3共4株耐酸菌株，通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析，確定4株耐酸菌株均屬于乳桿菌屬，其中，HLD1-3和YK1-2屬于乳桿菌屬的清酒乳桿菌，而JZ6-3和XC4-4屬于乳桿菌屬的植物乳桿菌，可作為潛在益生菌株作進(jìn)一步系統(tǒng)研究。該研究將為東北自然發(fā)酵酸菜中益生乳酸菌的分離篩選和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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Isolation and Identification of Lactobacillus Strains from Naturally Fermented Pickle Juice

WU Jun-rui，LI Xin，ZHANG Miao，LI Xiao-chen，YANG Chen-chen，YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Four acid-tolerant suspected Lactobacillus strains (HLD1-3, YK1-2, JZ6-3 and XC4-4) were isolated from five traditional pickle juices respectively collected from five regions of Liaoning province by selective cultivation and morphological observation. The four strains were identified based on physicochemical properties such as motility, catalase activity, litmus milk test, gelatin liquefaction test, growth under varying conditions of temperature NaCl concentration and carbohydrate fermentation tests and 16 S rDNA sequence analysis. The results indicated that all the strains belonged to the Lactobacillus genus. HLD1-3 and YK1-2 strains were identified as Lactobacillus sakei, while JZ6-3 and XC4-4 were identified as Lactobacillus plantarum. From these results, it can be speculated that naturally fermented pickle from Northeast China is a potential source of probiotic lactic acid bacteria.

pickle；acid tolerance；Lactobacillus；isolation

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0191-04

2011-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000805)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100902)；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(L2012249)

武俊瑞(1977—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品加工。E-mail:junruiwu@126.com

*通信作者:岳喜慶(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品加工。E-mail:yxqsyau@126.com