朱春玉，鄭方亮，邵麗杰，馮華煒，郭立雄，劉宏生*

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧省生物大分子計(jì)算模擬與信息處理工程研究中心，遼寧省動(dòng)物資源與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110036)

樺褐孔菌子實(shí)體與菌絲體三萜化合物提取及活性比較研究

朱春玉，鄭方亮，邵麗杰，馮華煒，郭立雄，劉宏生*

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧省生物大分子計(jì)算模擬與信息處理工程研究中心，遼寧省動(dòng)物資源與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110036)

為探索樺褐孔菌菌絲體與子實(shí)體在藥用價(jià)值上是否存在差別，采用有機(jī)溶劑冷浸、超聲回流法提取樺褐孔菌菌絲體及子實(shí)體的三萜化合物，通過薄層層析和紅外光譜分析，確定兩種來源的三萜化合物是相同或近似的同系物。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)和杯碟法測(cè)定兩種來源三萜化合物對(duì)癌細(xì)胞和細(xì)菌的抑制作用，菌絲體三萜化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803的最高抑制率可達(dá)到38.27%。結(jié)果證實(shí)人工培養(yǎng)的樺褐孔菌菌絲體同樣具有子實(shí)體的藥用價(jià)值，為人工培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體提供了依據(jù)。

樺褐孔菌；三萜化合物；抗腫瘤；抑菌活性

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目(無褐菌目)、多孔菌科、褐臥孔菌屬(纖孔菌屬)。中文名為白樺茸、黑樺菌、樺菌、斜管纖孔菌，被贊譽(yù)為“西伯利亞靈芝”[1]。

樺褐孔菌是一種耐寒的高等食藥用真菌，主要分布在北緯45°～50°的地區(qū)，樺褐孔菌子實(shí)體寄生于白樺、銀樺、赤楊等的樹干或樹皮下，形成木腐菌[2]。以往實(shí)驗(yàn)對(duì)樺褐孔菌的研究表明它不僅對(duì)癌癥、糖尿病有很好的治療效果，并且具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力和抗輻射抗氧化等功效[3-4]。但樺褐孔菌子實(shí)體只有在活的樺木上生長(zhǎng)10～15年才具有較高的藥用價(jià)值，且平均每2萬棵樺木中只有一棵生長(zhǎng)樺褐孔菌，資源十分稀少[5]。鑒于樺褐孔菌的藥用價(jià)值和資源現(xiàn)狀，人工培養(yǎng)的菌絲體具有巨大的潛在價(jià)值，對(duì)于菌絲體與子實(shí)體藥用價(jià)值的區(qū)別備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以采自長(zhǎng)白山的樺褐孔菌子實(shí)體及其人工培養(yǎng)的菌絲體為原材料，采用有機(jī)溶劑冷浸、超聲回流提取法提取樺褐孔菌菌絲體及子實(shí)體三萜化合物，對(duì)提取的三萜化合物的抗腫瘤和抑菌活性進(jìn)行比較，旨在為樺褐孔菌菌絲體內(nèi)三萜類物質(zhì)的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌LNUF008菌株由實(shí)驗(yàn)室分離保存。中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號(hào)為CCTCC M209280。大腸埃希式桿菌(Escherichia coli)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本實(shí)驗(yàn)室提供。人胃癌癌細(xì)胞株MGC-803，由遼寧大學(xué)陳長(zhǎng)蘭教授惠贈(zèng)。

白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度為98%) 杭州天草公司；胰蛋白酶、新生小牛血清、Eagle培養(yǎng)基(由Dulbecco改良，DMEM) 美國Gibco公司；RPMI-1640 美國HyClone公司；臺(tái)盼藍(lán)、青霉素G鈉鹽、二甲基亞砜(D M S O)、石油醚、氯仿、香草醛、噻唑藍(lán)、溴化鉀、濃硫酸、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)試劑純。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9802電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-260恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵 鞏義市硬峪予華儀器廠；KQ22DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BB15CO2培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Labsystems公司。

1.3 方法

1.3.1 三萜化合物提取

采用有機(jī)溶劑冷浸、超聲回流法提取樺褐孔菌體內(nèi)三萜化合物[6-7]，取已收集的樺褐孔菌菌絲體干粉及子實(shí)體干粉10g，無水乙醇冷浸24h后，超聲回流提取，提取溫度為50℃，超聲時(shí)間1h后，5000r/min離心10min，收集上清液，減壓濃縮至干，得到粗三萜化合物，觀察其外部形態(tài)。稱量殘?jiān)?jì)算粗三萜化合物回收率。

1.3.2 三萜化合物含量測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定樺褐孔菌三萜化合物的含量，以白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照[8]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確吸取以無水乙醇溶解的白樺脂醇。對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.016mg/mL)0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55mL，分別置于5mL容量瓶，在100℃水浴上蒸干后加入0.20mL新制的5g/100mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸搖勻，于70℃水浴保溫反應(yīng)15min后流水冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定量到5mL，搖勻，同時(shí)作試劑空白，以試劑空白對(duì)照和不同質(zhì)量濃度水平白樺脂醇對(duì)照品溶液分別在400～900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)為551nm。在551nm波長(zhǎng)處以試劑空白為參比，用1cm比色皿測(cè)定體系在551nm處的吸光度[9]。以白樺脂醇的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，A551nm為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

三萜化合物含量測(cè)定：取適量備用的三萜化合物溶液，按上述操作并在551nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜化合物的含量[10]。

1.3.3 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的薄層層析

將回流提取得到的樺褐孔菌子實(shí)體內(nèi)三萜化合物及菌絲體內(nèi)三萜化合物分別點(diǎn)樣于硅膠層析板上，距端點(diǎn)2～3cm。置于層析缸中，室溫展開，取出吹干，噴顯色劑，置于烘箱中加熱，顯色。展層劑：氯仿、乙酸乙酯、乙醚體積比為9:1:1，顯色劑：濃硫酸、甲醇體積比為1:1，通過斑點(diǎn)的顏色及位置比較兩種粗三萜化合物的組成成分的異同。

1.3.4 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的紅外光譜分析

取1～2mg樺褐孔菌三萜化合物樣品在瑪瑙研缽中，研磨成細(xì)粉末與干燥的溴化鉀粉末(約100mg，粒度200目)混合均勻，裝入模具內(nèi)，在壓片機(jī)上壓制成片測(cè)試。把制備好的樣品放入樣品架，然后插入儀器樣品室的固定位置上，按儀器的操作流程測(cè)定。

將樺褐孔菌子實(shí)體體內(nèi)三萜化合物的紅外圖譜及菌絲體體內(nèi)三萜化合物的紅外圖譜相對(duì)比，從待測(cè)化合物的紅外光譜特征吸收頻率及紅外特性吸收譜帶的出現(xiàn)來確定兩種來源的三萜化合物的紅外光譜是否一致，如果兩者光譜吸收峰位置和相對(duì)強(qiáng)度基本一致時(shí)，可判定待測(cè)化合物是相同或近似的同系物。

1.3.5 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的抗癌作用分析

所用癌細(xì)胞為胃癌MGC-803。以白樺脂醇為陽性對(duì)照通過MTT比色分析法[7]測(cè)定樺褐孔菌三萜化合物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。用胰蛋白酶消化匯合的單層細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至1×104CFU/mL，用加樣器在平底96孔板中的各孔中加入200μL細(xì)胞懸液，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育24h。將各樣品稀釋5個(gè)濃度，做平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度3次重復(fù)，加入孔中。培養(yǎng)68h后每孔中各加入50μL MTT，繼續(xù)溫育4h，離心棄去培養(yǎng)基和MTT，每孔中各加入200μL DMSO，振蕩以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶。利用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

用胰蛋白酶消化長(zhǎng)勢(shì)良好的單層細(xì)胞，吹打成均勻的細(xì)胞懸液，平均轉(zhuǎn)入3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶(A、B、C)中。在培養(yǎng)瓶A中加入新鮮DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶B中加入新鮮DMEM培養(yǎng)基及樺褐孔菌子實(shí)體粗三萜化合物至質(zhì)量濃度為0.08mg/mL，培養(yǎng)瓶C中加入新鮮DMEM培養(yǎng)基及樺褐孔菌菌絲體粗三萜化合物至質(zhì)量濃度為0.08mg/mL。于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育24h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)[11]。

1.3.6 兩種來源樺褐孔菌三萜化合物的抑菌作用

抑菌實(shí)驗(yàn)方法采用管碟法，混菌平板制好后，用無菌鑷子取無菌牛津杯置于混菌平板上，杯中加滿試樣，細(xì)菌在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，測(cè)量抑菌圈的直徑。試樣分別為各200μL的樺褐孔菌液體發(fā)酵液、樺褐孔菌三萜化合物、子實(shí)體三萜化合物，甲醇試劑對(duì)照。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，24h后觀察抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌三萜化合物的含量測(cè)定及形態(tài)觀察

樺褐孔菌三萜化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝1.45180.0967(R2＝0.9945)。計(jì)算提取液的樺褐孔菌菌絲體三萜化合物為93.85mg/g，比子實(shí)體中的略高。觀察并記錄子實(shí)體及菌絲體三萜化合物顏色、結(jié)晶狀態(tài)、黏稠度等外部形態(tài)，記錄如表1所示。

表1 樺褐孔菌三萜化合物比較分析Table 1 Comparative analysis of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus

2.2 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的薄層層析結(jié)果

圖1 樺褐孔菌子實(shí)體與菌絲體三萜化合物TLC結(jié)果Fig.1 TLC results of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus

將氯仿回流提取得到的樺褐孔菌子實(shí)體內(nèi)三萜化合物及菌絲體內(nèi)三萜化合物分別點(diǎn)樣于硅膠層析板上，展層后顯色，結(jié)果如圖1所示。樺褐孔菌子實(shí)體及菌絲體內(nèi)三萜化合物經(jīng)薄層層析(TLC)顯色后，斑點(diǎn)顏色及Rf值基本一致，初步證明利用氯仿冷浸超聲提取法所得三萜類化合物組成成分基本相同。

2.3 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物紅外光譜分析

圖2 樺褐孔菌體內(nèi)三萜化合物紅外光譜圖對(duì)比分析Fig. 2 Infrared spectral analysis of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus

由圖2可知，樺褐孔菌菌絲體及子實(shí)體內(nèi)三萜化合物光譜吸收峰位置和相對(duì)強(qiáng)度基本一致，兩種來源三萜類物質(zhì)的紅外光譜圖都在3050～3057cm-1有烯烴C－H伸縮吸收峰，1060～1070cm-1有羥基吸收峰，1704～721cm-1出現(xiàn)五元環(huán)酮的吸收峰等三萜類物質(zhì)的特征峰并且吸收頻率相差不大，由此可判定兩種三萜化合物是相同或近似的同系物。

2.4 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物抗癌作用分析

采用MTT比色分析法，通過對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體三萜化合物與菌絲體三萜化合物對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖作用的抑制率的測(cè)定，兩種三萜化合物的對(duì)比關(guān)系如圖3所示。

圖3 樺褐孔菌三萜化合物抑制胃癌細(xì)胞MGC-803增殖效果對(duì)比Fig. 3 Comparison of inhibitory effects of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus on the proliferation of gastric cancer cell MGC-803

由圖3可知，樺褐孔菌子實(shí)體及菌絲體內(nèi)三萜化合物對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖均具有抑制作用。兩種三萜化合物的抑制率隨著質(zhì)量濃度的升高顯著上升，當(dāng)三萜化合物的質(zhì)量濃度達(dá)到0.16mg/mL后，隨著質(zhì)量濃度的升高上升速度逐漸緩慢。當(dāng)質(zhì)量濃度到達(dá)0.32mg/mL菌絲體和子實(shí)體三萜化合物對(duì)胃癌細(xì)胞抑制率分別為(38.3±2.3)%和(28.4±1.9)%，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異極顯著，檢驗(yàn)結(jié)果表明樺褐孔菌菌絲體和子實(shí)體三萜化合物對(duì)胃癌細(xì)胞抑制率的差異極顯著(P＝0.002)，其中菌絲體三萜化合物抑制率更高。對(duì)照組白樺脂醇的抑制效果明顯低于實(shí)驗(yàn)組，這可能由于多種三萜類化合物的協(xié)同抑癌效果優(yōu)于單一的三萜化合物白樺脂醇的抑癌效果。

圖4 樺褐孔菌三萜化合物抑制胃癌細(xì)胞MGC-803顯微觀察圖Fig.4 Microscopic images of gastric cancer cell MGC-803 suppressed by triterpenoids from Inonotus obliquus

將正常細(xì)胞及加藥細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)。由圖4可知，加藥細(xì)胞明顯增殖速度緩慢，細(xì)胞壁皺縮，細(xì)胞小，胞質(zhì)突起，細(xì)胞器完整，胞膜完整。據(jù)細(xì)胞形態(tài)初步判斷，樺褐孔菌三萜化合物可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。由實(shí)驗(yàn)可知，樺褐孔菌菌絲體三萜化合物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制能力高于子實(shí)體內(nèi)三萜化合物。

2.5 兩種來源的樺褐孔菌三萜化合物的抑菌活性研究

表2 樺褐孔菌三萜化合物對(duì)4種細(xì)菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of triterpenoids from cultured mycelia and fruit bodies of Inonotus obliquus on four species of bacteria

由表2可知，樺褐孔菌三萜化合物對(duì)蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的抑菌效果具有差異性，對(duì)其他3種細(xì)菌的抑菌效果具有顯著性，組間比較對(duì)大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑制效果差異不顯著，說明樺褐孔菌三萜化合物對(duì)大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑制效果相差不大，對(duì)枯草芽孢桿菌(B.cubtilis)的抑制效果同其他3種細(xì)菌相比較最差，抑菌圈直徑僅為11.76mm，對(duì)蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑為24.67mm。實(shí)驗(yàn)顯示樺褐孔菌子實(shí)體與菌絲體中的三萜化合物的抑菌效果相當(dāng)，沒有明顯區(qū)別。

3 結(jié)論與討論

采用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的樺褐孔菌三萜化合物的提取方法，即用無水乙醇冷浸24h，50℃超聲回流提取1h，所得的樺褐孔菌三萜化合物產(chǎn)率最佳，提取的樺褐孔菌菌絲體三萜化合物可達(dá)到93.85mg/g，用乙醇作溶劑，避免使用其他有毒有害的試劑，降低了毒性。采用杯碟法測(cè)定樺褐孔菌菌絲體及子實(shí)體三萜化合物對(duì)大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)均有一定的抑制作用，其中對(duì)蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的抑制效果最為顯著，抑菌圈直徑為24.67mm。通過MTT比色法測(cè)定三萜化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803的最高抑制率可達(dá)到38.27%，并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)樺褐孔菌菌絲體三萜化合物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制能力高于子實(shí)體三萜化合物。

綜上所述，樺褐孔菌發(fā)酵菌絲體中的三萜化合物含量高、抗癌抗腫瘤功效顯著，優(yōu)于子實(shí)體內(nèi)三萜化合物。兩種來源的三萜化合物的抑菌活性差異不顯著。因此，利用樺褐孔菌的深層菌體發(fā)酵培養(yǎng)代替有限的野生子實(shí)體資源，生產(chǎn)三萜類活性物質(zhì)合理可行，為樺褐孔菌產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供了新的途徑。經(jīng)過近幾年國內(nèi)外的研究，特別是歐美國家，人們已經(jīng)從樺褐孔菌中提取到多種有效成分，進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，證實(shí)樺褐孔菌具有很好治療糖尿病、防止高血壓、抗癌、抗衰老、有效抑制傳染性病毒等作用[4,13-15]。鑒于樺褐孔菌的開發(fā)應(yīng)用前景，今后應(yīng)進(jìn)一步對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行更加深入系統(tǒng)的研究，開發(fā)研制樺褐孔菌系列保健醫(yī)藥食品[16-17]，使其為人類防病治病發(fā)揮更大的作用。

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Extraction and Bioactivity of Triterpenoids from Fruit Bodies and Mycelia ofInonotus obliquus

ZHU Chun-yu，ZHENG Fang-liang，SHAO Li-jie，F(xiàn)ENG Hua-wei，GUO Li-xiong，LIU Hong-sheng*
(Key Laboratory of Animal Resource and Epidemic Disease Prevention, Research Center for Computer Simulating and Information Processing of Bio-Macromolecules of Liaoning, College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

In order to explore the difference in medicinal value of cultured mycelia and fruit bodies ofInonotus obliquus, organic solvent cold soaking and ultrasonic reflux were adopted to extract triterpenoids from fruit bodies and mycelia ofInonotus obliquus. The triterpenoids extracted from both sources were determined to be the same or similar homologues by thin layer chromatography (TLC) and Fourier transform infrared (FT-IR) spectral analysis. Both triterpenoid extracts could inhibit the growth of cancer cells and bacteria as determined by tetrazolium salt assay (MTT) and cylinder plate method. The highest inhibitory rate of triterpenoids to human gastric cancer cell line MGC-803 reached up to 38.27%. Therefore cultured mycelia ofInonotus obliquushave the same medicinal value as fruit bodies.

Inonotus obliquus；triterpenes；anti-tumor activity；anti-bacterial activity

Q541

A

1002-6630(2012)15-0161-05

2011-09-28

遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2009S043)；遼寧大學(xué)青年科研基金項(xiàng)目(488020)

朱春玉(1978—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)及病毒學(xué)。E-mail：zhuchunyu@lnu.edu.cn

*通信作者: 劉宏生(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)及病毒學(xué)。E-mail：hongshengl@126.com