俞 浩，肖 新，劉漢珍，周金星，馬世堂，張孝林

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 蚌埠 233100)

滁菊總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

俞 浩，肖 新，劉漢珍，周金星，馬世堂，張孝林

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 蚌埠 233100)

目的：觀察滁菊總黃酮對Wistar大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的作用。方法：采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支30min后再灌注60min的方法復(fù)制急性MIRI大鼠模型，觀察滁菊總黃酮對MIRI大鼠心肌梗死范圍，血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性，血清及心肌中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，體外血栓長度及干、濕質(zhì)量，全血及血漿黏度的影響。結(jié)果：滁菊總黃酮能顯著減小MIRI大鼠心肌梗死范圍，降低血清CK、LDH活性，升高血清和心肌組織中SOD活性，降低MDA含量和體外血栓長度，減輕血栓干、濕質(zhì)量，改善全血黏度。結(jié)論：滁菊總黃酮對大鼠MIRI具有保護(hù)作用。

滁菊總黃酮；Wistar大鼠；心肌缺血再灌注損傷；脂質(zhì)過氧化

滁菊為菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)的干燥頭狀花序，產(chǎn)于安徽滁州，為我國享有盛名的道地藥材之一[1]。其味辛、甘、苦，性微寒，具有疏散風(fēng)熱、清肝明目、清熱解毒之功效，尤偏于平肝陽，常用于治療肝陽上亢所致的頭暈?zāi)垦５劝Y[2]?！吨兴幹尽份d：“滁菊花主產(chǎn)于安徽滁縣，品質(zhì)最佳”[3]?！冬F(xiàn)代實(shí)用中藥》載：“安徽滁州產(chǎn)者菊花最清涼，不苦不甜，白菊中以此為最良。俗謂杭菊濕，亳菊、徽菊燥，滁菊不濕不燥，故江浙一帶名醫(yī)處方中常以滁菊代替其他菊花，而其他菊花不能代替滁菊”[4]?？梢?，“四大名菊”中滁菊藥用價值最高。研究表明，菊花具有擴(kuò)血管、降血壓、強(qiáng)心、抗心肌缺血、抗腦缺血、抗脂質(zhì)過氧化損傷等多種藥理作用，其主要活性成分有黃酮、多糖和揮發(fā)油等[5-6]。但當(dāng)前有關(guān)滁菊及其活性成分的藥理作用研究尚未見文獻(xiàn)報道，本研究通過復(fù)制急性心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injuy，MIRI) Wistar大鼠模型，觀察滁菊總黃酮對大鼠MIRI的作用，為以滁菊總黃酮為原料的保健食品及新藥的開發(fā)研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性Wistar大鼠，購于安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司，體質(zhì)量240～280g。

滁菊總黃酮(總黃酮含量為76.38%) 安徽科技學(xué)院中藥及藥物制劑實(shí)驗(yàn)室制備；黃楊寧片 南京小營藥業(yè)集團(tuán)有限公司；戊巴比妥鈉 德國默克制藥公司；CK、LDH、SOD、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-5低速離心機(jī) 鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；FA21048電子天平 上海市精密科學(xué)儀器總廠；YDA-IV血液黏度計(jì)、體外血栓形成血小板黏附兩用儀 北京宏潤達(dá)科技發(fā)展有限公司；TU1810SPC紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試藥物的配制

分別稱取滁菊總黃酮適量，用生理鹽水溶解，配制成質(zhì)量濃度為10.4、5.2、2.6mg/mL的滁菊總黃酮溶液。稱取黃楊寧適量，用生理鹽水溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.12mg/mL的黃楊寧溶液。

1.3.2 動物分組與給藥

取大鼠84只，隨機(jī)分為6組，即滁菊總黃酮高、中、低劑量組(劑量分別為40、20、10mg/(kg·d))、黃楊寧片組(劑量為0.6mg/(kg·d))、模型組和假手術(shù)組，每組14只。各組大鼠均于每日上午9:00時灌胃給藥，每日1次，連續(xù)5d，給藥容量均為5mL/kg體質(zhì)量。假手術(shù)組和模型組給等容量的生理鹽水。

1.3.3 模型制備

參照文獻(xiàn)[7-10]方法并適當(dāng)改進(jìn)復(fù)制MIRI大鼠模型，末次給藥后1h，腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉大鼠，仰位固定，手術(shù)部位剪去毛，常規(guī)消毒皮膚，用止血鉗于左胸部4、5肋間隙打開胸腔，擠出心臟，在肺動脈圓錐左緣，左心耳根部下緣1～2mm處與冠狀動脈左前降支平行放置一實(shí)心硅膠管，用5/0無損傷縫合針結(jié)扎冠狀動脈左前降支及硅膠管，然后立即將心臟放回胸腔并縫合，使硅膠管一端暴露于胸腔外。以結(jié)扎后10min大鼠心電圖T波出現(xiàn)高聳或倒置為模型成功。結(jié)扎30min后，拔出硅膠管，恢復(fù)冠狀動脈左前降支血流，再灌注60min。假手術(shù)組重復(fù)上述操作過程但不結(jié)扎冠狀動脈左前降支。每組選成模大鼠10只。

1.3.4 心肌梗死范圍的測定

大鼠經(jīng)再灌注60min后，打開胸腔，分離心臟，生理鹽水洗凈余血，濾紙吸盡水分，剪取缺血區(qū)下心肌，將心肌切成4～5片，每片厚約0.1cm，取3片置0.5g/100mL的氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色液中，37℃恒溫水浴中染色15min，取出，濾紙吸盡水分，稱質(zhì)量；分離梗死區(qū)(該區(qū)域呈白色)，稱質(zhì)量；計(jì)算梗死范圍。

1.3.5 血清CK、LDH、SOD活性及MDA含量的測定

大鼠經(jīng)再灌注60min后，剪開腹腔，腹主動脈取血于試管中，靜置30min，4200r/min離心15min，取上清，按試劑盒操作方法測定大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.6 心肌中SOD活性、MDA含量的測定

大鼠經(jīng)再灌注60min后，剪開胸腔，取心臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸盡水分，于缺血區(qū)近心尖處取心肌，稱質(zhì)量，置玻璃勻漿器中，按質(zhì)量體積比1:9加生理鹽水勻漿，勻漿液4200r/min離心15min，取上清，按試劑盒操作方法測定大鼠心肌中SO D活性、MD A含量。

1.3.7 體外血栓長度及干、濕質(zhì)量測定

腹主動脈取血，取1mL迅速注入血栓管中，并將血栓管兩端對接形成環(huán)狀，固定于體外血栓形成血小板黏附兩用儀上，旋轉(zhuǎn)15min，取出血栓，測定血栓長度。濾紙吸凈血栓中水分，稱質(zhì)量，得血栓濕質(zhì)量。然后將血栓置65℃烘箱中干燥1h，取出稱質(zhì)量，得血栓干質(zhì)量。

1.3.8 全血黏度、血漿黏度的測定

取0.8mL抗凝血置血液黏度計(jì)中，測定全血黏度。將剩余抗凝血置離心機(jī)上4200r/min離心15min，取上清液0.8mL置血液黏度計(jì)中，測定血漿黏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 滁菊總黃酮對MIRI大鼠心肌梗死范圍的影響

表1 滁菊總黃酮對MIRI大鼠心肌梗死范圍的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv.Chuju flowers on myocardial infarction area in MIRI rats(±s，n=10)

表1 滁菊總黃酮對MIRI大鼠心肌梗死范圍的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv.Chuju flowers on myocardial infarction area in MIRI rats(±s，n=10)

注：*.與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)；**.與模型組比較，差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別 劑量/(mg/(kg·d))缺血心肌質(zhì)量/g 梗死區(qū)質(zhì)量/g 梗死范圍/%模型組 0.47±0.12 0.16±0.04 36.90±8.71假手術(shù)組 0.43±0.10黃楊寧片組 0.6 0.46±0.11 0.10±0.03 23.10±10.87**高劑量組 40 0.51±0.08 0.12±0.03 24.30±5.62**滁菊總黃酮 中劑量組 20 0.46±0.04 0.12±0.04 25.60±9.97**低劑量組 10 0.51±0.09 0.16±0.03 32.90±8.67

由表1可知，滁菊總黃酮高、中劑量組均能顯著減小MIRI大鼠心肌梗死范圍，與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，說明滁菊總黃酮能夠減輕MIRI所致的心肌梗死程度。

2.2 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血清CK、LDH活性的影響

表2 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血清中CK、LDH活性的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on the activities of CK and LDH in serum of MIRI rats (±s，n=10)

表2 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血清中CK、LDH活性的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on the activities of CK and LDH in serum of MIRI rats (±s，n=10)

組別 劑量/(mg/(kg·d) CK活性/(U/mL) LDH活性/(U/mL)模型組 56.69±4.48 11.23±2.36假手術(shù)組 27.60±8.38** 1.65±0.35黃楊寧片組 0.6 38.29±8.67** 3.62±1.21**高劑量組 40 32.31±6.47** 4.82±1.37**滁菊總黃酮 中劑量組 20 34.32±5.68** 5.79±3.27**低劑量組 10 45.29±5.86** 6.99±2.48**

由表2可知，模型大鼠血清中CK、LDH活性顯著升高，滁菊總黃酮高、中、低劑量組大鼠血清中CK、LDH活性顯著下降，與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，說明滁菊總黃酮能夠降低MIRI引起的大鼠血清CK、LDH活性的升高。

2.3 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血清及心肌中SOD活性、MDA含量的影響

由表3可知，缺血再灌注后模型大鼠血清及心肌組織中SOD活性顯著下降，MDA含量顯著升高。滁菊總黃酮高、中劑量組大鼠血清中SOD活性顯著升高，與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)；滁菊總黃酮高、中、低劑量組大鼠血清中MDA含量顯著下降，與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)。滁菊總黃酮高、中劑量組大鼠心肌中SOD活性顯著升高，MDA含量顯著下降，與模型組比較具有極顯著性差異(P＜0.01)，說明滁菊總黃酮能夠改善MIRI引起的過氧化損傷。

2.4 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血栓長度和干、濕質(zhì)量的影響

表4 滁菊總黃酮對MIRI大鼠體外血栓長度和干、濕質(zhì)量的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on thrombus length as well as dry and wet weight of thrombi in MIRI rats (±s，n=10)

表4 滁菊總黃酮對MIRI大鼠體外血栓長度和干、濕質(zhì)量的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on thrombus length as well as dry and wet weight of thrombi in MIRI rats (±s，n=10)

組別 劑量/(mg/( kg·d)) 血栓長度/cm 血栓濕質(zhì)量/g 血栓干質(zhì)量/g模型組 5.93±1.18 0.64±0.16 0.29±0.11假手術(shù)組 3.32±1.14 0.30±0.12 0.13±0.09黃楊寧片組 0.6 3.16±0.19** 0.32±0.21* 0.14±0.04**高劑量組 40 3.08±0.91** 0.29±0.15** 0.16±0.03**滁菊總黃酮 中劑量組 20 3.45±1.13** 0.54±0.16 0.24±0.10低劑量組 10 4.61±2.01 0.55±0.12 0.26±0.14

表3 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血清及心肌組織中SOD、MDA含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on SOD activities and MDA contents in serum and myocardium of MIRI rats (± s，n=10)

表3 滁菊總黃酮對MIRI大鼠血清及心肌組織中SOD、MDA含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on SOD activities and MDA contents in serum and myocardium of MIRI rats (± s，n=10)

組別 劑量/(mg/(kg·d)) 血清 心肌組織SOD活性/(NU/mL) MDA含量/(nmol/mL) SOD活性/(IU/mg) MDA含量/(nmol/mg)模型組 176.66±20.87 13.17±2.81 49.92±6.38 10.21±3.36假手術(shù)組 266.70±26.29 4.21±1.89 78.40±6.31 2.37±0.58黃楊寧片組 0.6 235.29±28.60** 5.99±1.93** 64.31±4.75** 4.48±1.39**高劑量組 40 224.58±31.23** 6.12±2.49** 66.82±3.38** 4.86±2.24**滁菊總黃酮 中劑量組 20 220.92±11.89** 8.02±2.17** 58.46±4.41** 6.54±3.41**低劑量組 10 198.44±25.77 9.83±1.37** 51.32±9.42 8.90±4.21

表5 滁菊總黃酮對MIRI大鼠全血黏度、血漿黏度的影響 (±s，n=10)Table 5 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on viscosity of whole blood and plasma in MIRI rats(±s，n=10)

表5 滁菊總黃酮對MIRI大鼠全血黏度、血漿黏度的影響 (±s，n=10)Table 5 Effect of total flavonoids from Dendranthema morifolium (Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on viscosity of whole blood and plasma in MIRI rats(±s，n=10)

組別 劑量/(mg/(kg·d)) 全血黏度/(mPa·s) 血漿黏度/(mPa·s)高切 中切 低切模型組 5.61±0.50 8.04±0.53 14.26±1.85 1.59±0.04假手術(shù)組 3.27±0.37 5.03±0.28 11.82±1.15 1.51±0.13黃楊寧片組 0.6 4.19±0.45** 5.23±1.02** 11.85±1.16** 1.52±0.10高劑量組 40 4.24±0.38** 5.51±0.23** 11.89±1.43** 1.52±0.18滁菊總黃酮 中劑量組 20 4.42±0.48** 5.48±0.35** 11.91±1.36** 1.53±0.26低劑量組 10 4.51±0.33** 5.60±0.16** 12.03±1.32* 1.55±0.09

由表4可知，滁菊總黃酮高、中劑量組血栓長度顯著低于模型組，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；滁菊總黃酮高劑量組血栓濕、干質(zhì)量均顯著低于模型組，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果表明滁菊總黃酮具有抑制血栓形成的作用。

2.5 滁菊總黃酮對MIRI大鼠全血黏度、血漿黏度的影響

由表5可知，與模型組比較，滁菊總黃酮高、中、低劑量組均能顯著降低大鼠全血黏度(P＜0.05或P＜0.01)，說明滁菊總黃酮具有降低大鼠全血黏度作用；滁菊總黃酮各劑量組對MIRI大鼠血漿黏度有一定的降低作用，但與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討 論

MIRI是指缺血心肌組織在恢復(fù)血流后，心肌供血改善的同時又加重了單純性心肌缺血所造成的損傷，其發(fā)生機(jī)制主要與氧自由基損傷、鈣超載及血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)功能障礙有關(guān)。

NBT能與活性酶作用，缺血性損傷達(dá)一定程度時，心肌組織中能量代謝障礙，酶活性降低或消失，故正常心肌被染成藍(lán)色，而梗死區(qū)不著色。血清中 LDH 活性是反映心肌缺血程度的一個重要指標(biāo)，CK是心肌細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一。MIRI能造成細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)各種酶釋放入血，通過檢測血清中LDH、CK的變化可以間接判斷心肌受損情況[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滁菊總黃酮能顯著減小MIRI大鼠心肌梗死范圍，降低血清中CK、LDH活性，說明滁菊總黃酮能對抗缺血再灌注引起的心肌損傷。

自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是MIRI的重要環(huán)節(jié)，MIRI導(dǎo)致自由基生成增加，使心肌細(xì)胞中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化。SOD是超氧自由基的清除劑，對保護(hù)心肌細(xì)胞免受自由基損傷起重要作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，間接地反映心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度。MIRI時由于自由基清除酶的活性降低，導(dǎo)致氧自由基堆積，進(jìn)而使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷[13-15]。滁菊總黃酮能顯著升高血清和心肌組織中SOD活性，降低MDA含量，提示滁菊總黃酮能抑制MIRI引起的脂質(zhì)過氧化損傷。

研究表明，MIRI時造成的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)異常和氧自由基引起的紅細(xì)胞膜損傷等均可導(dǎo)致膜的穩(wěn)定性和流動性降低，血漿纖維蛋白原生成增加，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形能力下降，聚集性增高。同時，MIRI造成血管內(nèi)皮損傷，使微循環(huán)血流紊亂，紅細(xì)胞聚集性進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致血黏度增加，血黏度的增加又促進(jìn)了血栓的形成，進(jìn)一步加重MIRI[16]。本實(shí)驗(yàn)研究表明滁菊總黃酮能降低體外血栓長度和干、濕質(zhì)量，降低全血黏度，從而有效防止血栓形成，改善缺血心肌的血液供應(yīng)，促進(jìn)MIRI的恢復(fù)。

本研究在載體MIRI大鼠模型的基礎(chǔ)上證實(shí)滁菊總黃酮具有抗MIRI作用，通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)滁菊總黃酮的抗MIRI作用以及明確其抗MIRI的機(jī)制有待進(jìn)一步去研究。

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Effect of Total Flavonoids fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju Flowers on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rats

YU Hao，XIAO Xin，LIU Han-zhen，ZHOU Jin-xing，MA Shi-tang，ZHANG Xiao-lin
(College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Bengbu 233100, China)

Objective: To observe the effect and underlying mechanism of total flavonoids extracted fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI) in rats. Methods: Acute MIRI mouse models were created by reperfusion for 60 min after anterior interventricular branch of the left coronary artery for 30 min.The infarction area of myocardium, serum creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) activities, SOD activity in serum and myocardium, and MDA content in serum and heart tissue were determined. Thrombus length, dry and wet weight of thrombi, and viscosity of whole blood and plasma were also evaluated. Results: Total flavonoids romDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers could decrease the infarction area of myocardium, reduce serum CK and LDH activity,improve the activity of SOD in serum and heart tissue, decrease MDA content in serum and heart tissue, reduce thrombus length,wet weight and dry weight of thrombiin vitro, and improve the viscosity of whole blood. Conclusion: Total flavonoids fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers can protect against MIRI in rats.

total flavonoids fromDendranthema morifolium(Ramat) Tzvel. cv. Chuju flowers；Wistar rat；myocardial ischemia reperfusion injury；lipid preoxidation

R965.1

A

1002-6630(2012)15-0283-04

2011-08-19

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(10040606Q13)；科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動項(xiàng)目(2009GJC30034)；安徽科技學(xué)院穩(wěn)定人才項(xiàng)目(ZRC2011297)

俞浩(1975—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)和保健食品學(xué)。E-mail：yhz_1230@163.com