孟令鍇，李潔，高長久

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011 2.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院）

金絲桃屬（HypericumL.）為藤黃科（Clusiaceae）。該屬全世界約有400余種，我國有55種，8亞種。該屬植物的一些種在國內(nèi)外廣為藥用，主要用于治療抑郁癥、肝炎、痢疾，有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、收斂等功效。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為其具有清熱解毒、收斂止血、利濕之功效，用于治療咯血、吐血、外傷出血、風(fēng)濕骨痛、口鼻生瘡等癥［7］。國內(nèi)外對該屬植物的研究極為重視。黑龍江省分布的烏腺金絲桃（H.attenuatumChoisy.）和長柱金絲桃（H.ascyronL.）的研究較少，主要集中在原植物形態(tài)、生藥性狀、顯微特征及部分化學(xué)成分含量的測定及分析等傳統(tǒng)生藥學(xué)領(lǐng)域。

在目前生藥學(xué)研究中，主要應(yīng)用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、化學(xué)等物種特異性遺傳標(biāo)記特征，這些特征特別是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的鑒別方法雖然有著簡便、易行等優(yōu)點(diǎn)，然而有很多特征為生物體的遺傳物質(zhì)與外界環(huán)境及其他多種因素共同作用的結(jié)果，他們在受遺傳因素影響的同時(shí)，也受到如土壤、氣候、陽光等因素的影響，而DNA作為遺傳物質(zhì)，他保持著遺傳特性，不受外界因素影響，用DNA遺傳物質(zhì)進(jìn)行物種鑒定，具有準(zhǔn)確性和可靠性。為此，本研究對金絲桃屬兩種藥用植物進(jìn)行RAPD反應(yīng)的初步研究，旨在為黑龍江省金絲桃屬植物RAPD的有效鑒定奠定基礎(chǔ)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

取供試材料植株新鮮嫩葉片經(jīng)硅膠干燥保存。烏腺金絲桃：2011年7月采于黑龍江省牡丹江鏡泊湖地區(qū)。長柱金絲桃：2011年7月采于黑龍江省橫道河地區(qū)；PCR 擴(kuò)增儀，Thermo Electron Corporation；YLN－2000凝膠成像分析系統(tǒng)，北京亞力恩機(jī)電技術(shù)研究所；DYY－8B電泳儀，北京六一儀器廠；DU－800核酸蛋白質(zhì)分析儀，美國BECKMAN公司。

1.2 試劑

隨機(jī)引物（primer）、DGL2000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、d NTPs、10×buffer、mgcl2、瓊脂糖均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取

采用北京鼎國生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA抽提試劑盒提取。

操作步驟：

第1步：組織≤0.5g，液氮研磨，加入1m L溶液B，反復(fù)搖均，室溫5min。

第2步：加入2.5 m L溶液C，20μL溶液 A，充分搖均，室溫放置20min。

第3步：≥8000rpm離心3 min。

第4步：取上清，加入50μL溶液D，≥8000rpm離心1 min，棄上清。

第5步：加入80μL溶液C，搖均，≥8000rpm離心5 min，棄上清。

第6步：加入1m L溶液E，搖均，≥8000rpm離心30～60s，棄上清。

第7步：重復(fù)步驟6。

第8步：≥12000rpm離心30～60s，吸干上清，室溫敞開晾干約5～10min。

第9步：取250μL溶液F，搖均，40～50℃水浴3～5 min。

第10步：≥12000rpm離心30～60s，取上清，即為DNA。

1.3.2 供試材料基因組DNA檢測

供試材料基因組DNA質(zhì)量檢測在DU－800核酸蛋白質(zhì)分析儀上進(jìn)行。取1μL的DNA溶液和99μL的TE Buffer于石英比色皿中，混勻，以TE Buffer為對照液，測定波長260nm、280nm的OD260、OD280值，計(jì)算OD260／OD280的比值以得樣品的純度，并按總DNA含量（μg／m L）＝ OD260×50×100，計(jì)算各樣品DNA的濃度。

1.3.3 RAPD反應(yīng)

反應(yīng)總體積25μL。依次加超純水，1μmol／L引物，10 倍 PCR 緩 沖 液 （10mmol／L Tris，p H9.2），25mmol／L KCl，1.5mmol／L MgCl2，0.2mmol／L d NTPs，40ng左右模板DNA，1UTaq酶。

擴(kuò)增程序：

①193℃，2min。

②293℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸反應(yīng)1.5min，45個(gè)循環(huán)。

③72℃，保溫5min，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。

1.3.4 隨機(jī)引物的篩選

從樣本中選出具有代表性的且總DNA質(zhì)量相對較好的樣品作為代表，利用上文中得到的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在30個(gè)隨機(jī)引物中（10bp）進(jìn)行篩選，選擇具有穩(wěn)定的、能擴(kuò)增出具有多態(tài)性帶的有效引物。

1.3.5 PCR產(chǎn)物鑒定與記錄

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（在1×TAE中）分離與鑒定，在紫外透射儀上觀察與照相，以DGL2000為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 供試材料總DNA的質(zhì)量

DNA 質(zhì) 量 在 DU－800 上 測 定 OD260、OD280及OD260／OD280值及濃度。見表1。

表1 供試材料基因組DNA的紫外分析結(jié)果

2.2 引物篩選結(jié)果

圖1 部分引物篩選結(jié)果

2.3 供試材料基因組的部分指紋圖譜

圖2 烏腺金絲桃、長柱金絲桃RAPD指紋圖譜

由擴(kuò)增圖譜可知：S75、S76、S80引物對烏腺金絲桃及長柱金絲桃基因組DNA擴(kuò)增，圖譜表明兩種植物均在200bp左右有相同長度條帶，同時(shí)也有不同的條帶出現(xiàn)，說明其在遺傳上既具有相似性，又存在差異，根據(jù)這些差異可以有效鑒別金絲桃屬兩種近緣植物烏腺金絲桃及長柱金絲桃。如應(yīng)用S75烏腺金絲桃在2000 bp左右有一DNA譜帶出現(xiàn)，而長柱金絲桃此條帶缺失，該條帶的有無可以有效鑒別這兩種近緣植物。

3 結(jié)論

本課題研究結(jié)果顯示，應(yīng)用RAPD方法可以準(zhǔn)確、快速、簡便地鑒定中藥，且只需很少量的樣品就可完成。引物S75、S76、S80可作為烏腺金絲桃、長柱金絲桃的高特異性引物，用這三種鑒別引物對樣品的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，就可以準(zhǔn)確鑒別。