張彥波,張希太,謝淑芹,肖磊

（河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心,河北邯鄲056001）

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一,也是我國的第二大糧食作物.我國小麥常年種植面積在0.3億hm2以上.小麥育種工作一直是農(nóng)業(yè)科研關(guān)注的問題,隨著人口的持續(xù)增長和耕地面積的不斷減少,我國的糧食問題表現(xiàn)得更加突出,尋求具有抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因小麥和彌補(bǔ)種質(zhì)資源的短缺一直是從事小麥研究的科研工作者不懈努力的目標(biāo).C4植物（高粱、玉米等）具有生育期短、高光合效率、高產(chǎn)量等突出特點(diǎn),近年來,一些育種工作者探索著將高光效的C4植物的總DNA導(dǎo)入C3植物并取得了一定的成績[1].詹慶才等[2]采用花粉管通道法將玉米、高粱、稗子總DNA導(dǎo)入栽培水稻中,后代在抽穗期、穗型、株高、生育期等方面出現(xiàn)了變異.倪建福[3]通過花粉管通道將高粱總DNA導(dǎo)入3個春小麥品種,經(jīng)過多代選擇獲得了多個穩(wěn)定的品系.于元杰[4]、張希太等[5-7]將高粱DNA和牛胸腺DNA導(dǎo)入“周麥16”、“藁優(yōu)9415”、“矮抗58”等冬小麥品種選育出了多個變異種質(zhì)系.為了在“豫麥66”的遺傳基礎(chǔ)上創(chuàng)造新的冬小麥品種資源,我們開展了將高粱DNA導(dǎo)入“豫麥66”選育新的冬小麥變異種質(zhì)系的研究.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體為高粱“抗5”種子,由河北省張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈送；受體材料為“豫麥66”種子,由河南省蘭考天民種業(yè)贈送。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高粱DNA的提取與導(dǎo)入液的制備 先將高粱“抗5”的種子播種到沙盤中,長成幼苗后剪取幼嫩部分,采用CTAB法提取總DNA并純化.將純化后的DNA溶于1×TE緩沖液,取少量DNA液稀釋后用紫外分光光度計測定 OD260、OD230、OD280的值,若 OD260/OD230≥2.0 且 OD280/OD260≥1.8,表明 DNA 的純度達(dá)標(biāo),否則繼續(xù)純化直至達(dá)標(biāo)；計算DNA母液的質(zhì)量濃度（DNA母液的質(zhì)量濃度/（μg/mL）=稀釋倍數(shù)×OD260×50）,根據(jù)DNA母液的質(zhì)量濃度和花粉管通道法導(dǎo)入的要求用0.1×TE緩沖液稀釋母液到500 μg/mL并按每10 mL加入1 μL的“Triton X-100”后即為導(dǎo)入液,分裝后在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2 DNA的花粉管通道法導(dǎo)入 在大田小麥的抽穗揚(yáng)花期,選擇大部分小花正在揚(yáng)花的“豫麥66”的麥穗作為導(dǎo)入材料,在揚(yáng)花后2 h開始整穗,去掉尚未開放或已開過的小花,在穎片內(nèi)沿柱頭與子房頸分叉處剪去羽毛狀柱頭,立即用微量注射器滴加8～10 μLDNA導(dǎo)入液于子房頸切口處,然后套袋并掛標(biāo)簽標(biāo)記.2～4 h后復(fù)滴1次,以滴加0.1×TE緩沖液（按每10 mL加入1 μL的“Triton X-100”）的受體材料作為對照.

1.2.3 后代材料的收獲種植與選擇 小麥成熟后按處理穗和對照穗分別收獲,并分別脫粒后保存D0代種子.當(dāng)年的9月底在大田中,將DNA導(dǎo)入處理的D0種子按小區(qū)單穴單粒播種,并以同樣的方法種植經(jīng)0.1×TE緩沖液處理的種子為對照.第二年小麥成熟收割前進(jìn)行大田調(diào)查與選擇,主要調(diào)查DNA導(dǎo)入處理的變異株率、變異類型等,然后選擇各具特色的優(yōu)良的變異單株,按株系脫粒保存D1代種子.以后每年按株系單穴單粒播種,并逐年選擇直到獲得穩(wěn)定的變異株系.

1.2.4 穩(wěn)定變異株系的SSR分子標(biāo)記檢測

模板DNA的提取：采用SDS法并參照文獻(xiàn)[3]的方法,從樣品小麥暗培養(yǎng)的黃花麥芽中提取DNA并純化,然后取少量的DNA樣品溶于無菌的超純水中制成質(zhì)量濃度約為20 ng/μL的模板液.

PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與引物的選擇：根據(jù)Roder發(fā)表的SSR引物[4-5],隨機(jī)選取分布于各對染色體上的SSR引物32對,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.PCR反應(yīng)采用25 μL體系,其中Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μL,DNA 模板液 0.5 μL,上下游引物各 1 μL,25 mmol/L MgCl22 μL,各種核苷酸濃度均為 2.5 mmol的 dNTP 1 μL,10×buffer 2.5 μL,無菌超純水 16.8 μL,礦物油 15 μL.PCR 反應(yīng)在英國TECHNE公司生產(chǎn)的TC-5000 PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min,94℃變性50 s,50℃退火50 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán)；72℃后延伸5 min,4℃保存.

擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,每泳道上樣量為8 μL,在200 V恒電壓下電泳2.5 h,剝膠,銀染,照相,進(jìn)行擴(kuò)增條帶的分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱“抗5”DNA導(dǎo)入小麥“豫麥66”D1代、D2代性狀變異的統(tǒng)計分析

2004年5 月份我們采用花粉管通道法將高粱“抗5”的DNA導(dǎo)入“豫麥66”小麥單穗106個,共收獲D0代種子1 960粒,當(dāng)年10月初在試驗(yàn)田中將D0代種子采用單穴單粒播種,共出D1代苗1 710株.同樣采用單穴單粒播種0.1×TE緩沖液處理的種子為對照.從D1代就開始出現(xiàn)少量的變異單株,2005年10月份,我們從D1代中共選出13個變異單株分別按株系單穴單粒播種,并播種適量的“豫麥66”作為對照.從D2代開始我們選擇優(yōu)良變異單株,淘汰劣變,直到獲得穩(wěn)定的株系為止.高粱“抗5”DNA導(dǎo)入小麥“豫麥66”D1代D2代性狀變異的統(tǒng)計結(jié)果見表1.

表1 D1代和D2代性狀變異率

由表1可見,高粱“抗5”的DNA采用花粉管通道法導(dǎo)入“豫麥66”后,從D1代就開始出現(xiàn)少量的變異單株,變異率僅為0.8%.將D1代選出的13個變異單株分別按株系單穴單粒播種,產(chǎn)生的D2代中變異株數(shù)和變異率均顯著升高.在D2代中13個株系均發(fā)生性狀分離,大部分株系除分離出各種變異類型外還分離出一定數(shù)量的“豫麥66”原型.

D1代D2代性狀變異類型統(tǒng)計結(jié)果見表2.

表2 D1代、D2代性狀變異類型

由表2可見,13個D1代變異單株的性狀變異類型分別表現(xiàn)在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、旗葉、成熟期幾個方面,用0.1×TE緩沖液處理的對照種子在D1代無變異出現(xiàn).將D1代選出的13個變異單株分別按株系單穴單粒播種,得到的D2代變異單株的性狀變異類型也基本上表現(xiàn)在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、旗葉、成熟期幾個方面.

2.2 D66-6和D66-1的SSR分子標(biāo)記檢測結(jié)果

從D3代開始已經(jīng)有部分株系表現(xiàn)穩(wěn)定,經(jīng)過多代的選擇,目前我們已經(jīng)從高粱“抗5”的DNA導(dǎo)入“豫麥66”的變異系統(tǒng)中獲得穩(wěn)定的各具特點(diǎn)的種質(zhì)系4個.其中D66-6和D66-1兩個品系綜合農(nóng)藝性狀好,經(jīng)2年計產(chǎn)對比試驗(yàn),平均產(chǎn)量分別超對照品種“石4185”8.38%和9.64%.為了給D66-6和D66-1尋找分子水平的證據(jù),為今后參加品種區(qū)域試驗(yàn)做準(zhǔn)備,我們對“豫麥66”、D66-6、D66-1、高粱“抗5”的DNA進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記檢測,結(jié)果見表3.

表3 SSR分子標(biāo)記檢測

由表3可見,在用于SSR分子標(biāo)記檢測的32對引物中有5對引物檢出較豐富的多態(tài)性片段,所用引物的多態(tài)性片段檢出率達(dá) 15.6%.其中引物 xgwm148、xgwm614、xgwm295、xgwm328、xgwm257 在“豫麥66”、D66-6、D66-1、高粱“抗5”的DNA中檢出較豐富的多態(tài)性條帶（見圖1）.這些多態(tài)性條帶中和對照“豫麥66”相比有的是新增條帶,有的是缺失條帶.

圖1 5對引物的檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

高粱“抗5”的DNA采用花粉管通道法導(dǎo)入“豫麥66”后,D1代就開始在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、旗葉、成熟期幾個方面出現(xiàn)少量的變異單株；在D2代中變異株系均發(fā)生性狀分離,D3代開始出現(xiàn)穩(wěn)定的品系.用SSR分子標(biāo)記檢測D66-6和D66-1兩個穩(wěn)定品系,引物xgwm148、xgwm614、xgwm295、xgwm328、xgwm257檢測出了較豐富的多態(tài)性DNA片段.

本試驗(yàn)中,用SSR分子標(biāo)記檢測D66-6和D66-1兩個穩(wěn)定品系的基因組DNA時只檢出了和“豫麥66”不同的多態(tài)性片段,沒有檢測出高粱“抗5”的DNA所特有的帶型,有待于加大引物的使用數(shù)量,進(jìn)一步檢測.本研究結(jié)果表明,利用外源DNA導(dǎo)入技術(shù)可實(shí)現(xiàn)小麥遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移,極大地豐富了小麥遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),為創(chuàng)造新的突破性的種質(zhì)資源材料開辟了有效途徑.

[1]周文鱗,倪建福,王亞馥,等.外源 C4作物 DNA 導(dǎo)入小麥的研究[J].作物學(xué)報,1992,18（6）：418-423.

[2]詹慶才,劉志剛,張玉燭,等.外源DNA導(dǎo)入水稻引起形狀變異的研究[J].作物研究,1995,9（2）：10-11.

[3]倪建福.高粱DNA導(dǎo)入小麥選育出抗條銹病白粒新品系[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,1994（7）：10-11.

[4]于元杰.超遠(yuǎn)緣DNA導(dǎo)入小麥選育種質(zhì)系的研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2000,2（增刊）：32-35.

[5]張希太,謝淑芹,張彥波,等.高粱DNA導(dǎo)入小麥“周麥16”引起后代變異的研究及SSR分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39（15）：8872-8874.

[6]張希太.牛胸腺DNA導(dǎo)入“藁優(yōu)S415”后代變異及SSR分析[J].安徽農(nóng)學(xué)通報,2011,17（7）：41-44.

[7]張希太,謝淑芹,張彥波,等.牛胸腺DNA導(dǎo)入“矮抗58”后代變異及SSR分析[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2011,31（2）：151-155.

[8]王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社,1998：598-599.