祝秀梅，馬全英，杜 平，王 凡，呂志慧，牟克斌

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987年首先出現(xiàn)于美國［1］，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起。其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬感染后的成活率下降。PRRS的一顯著特性是具有高度傳染性，1987年在北美首次爆發(fā)后，迅速在全球蔓延［2－3］，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了嚴重的危害。十多年來，因它給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失而引起了科學界的關(guān)注。2006年在我國暴發(fā)的高熱病，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的破壞，由于診斷不及時，未做好應對工作，使許多中小型豬場因此倒閉，養(yǎng)殖戶損失慘重［4－5］。因此建立快速有效實用的診斷方法是防制PRRS流行的重要環(huán)節(jié)。目前的診斷方法存在操作復雜費時、靈敏度或特異性不強等缺點。普通RT-PCR易出現(xiàn)假陽性，且核酸染色劑（溴化乙錠，EB）對人體健康有很大的危害。

實時熒光定量PCR（Real-time PCR）具有敏感性和特異性高、重復性和穩(wěn)定

性好、耗時短、無污染的特點，已成為核酸定量檢測的首選方法而得到廣泛應用［6－8］。本研究選用PRRSV中的最保守的ORF7基因，設計引物和探針，建立了檢測PRRSV的TaqMan實時熒光定量PCR，并對體系進行了優(yōu)化。分別進行特異性、敏感性、穩(wěn)定性試驗，并對臨床樣品進行檢測，建立了可準確、快速檢測PRRSV的方法。

1 材 料

1.1 毒株 PRRSV SY0608細胞毒均由本實驗室分離、鑒定并保存PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV細胞毒均為本實驗室保存；臨床樣品采自周邊地區(qū)豬場。

1.2 試劑與儀器 病毒基因組RNA提取試劑盒購自 QIAGEN 公司，Premix ExTaqTM、T4DNA ligase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex-Taq聚合酶、pMD-18T、DNA Marker等均購自TaKaRa（大連）公司；DNA膠回收試劑盒購自Promega公司；熒光定量PCR儀為StrataGen公司產(chǎn)品（Mx3000P）。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank上下載的PRRSV基因組全序列進行比對，找出PRRSV ORF7相對保守的區(qū)域，設計一對引物和探針，并送至寶生物工程（大連）有限公司合成。引物、探針序列如下。

2 方 法

2.1 標準陽性模板的制備

2.1.1 ORF7基因的擴增 按照QIAGEN RNA提取試劑盒說明書，從PRRSV感染的細胞培養(yǎng)物中提取病毒全基因組RNA，用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Oligo（dT）進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，用PRRSV上、下游引物擴增PRRSV ORF7基因，擴增條件為：94℃4min；94℃1min，58℃45s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃8min。反應結(jié)束后取8μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

2.1.2 ORF7基因的克隆與鑒定 將擴增出的ORF7基因按膠回收試劑盒說明回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化工程菌DH5α感受態(tài)細胞，通過抗性篩選挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜至液體混濁，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并分別進行酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序。

2.1.3 標準陽性模板的稀釋 用紫外分光光度計分別測定陽性重組質(zhì)粒的OD260和OD280，并計算濃度與拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋后作為標準陽性模板，用于熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化和標準曲線的建立。

2.2 不同探針濃度對擴增產(chǎn)物量的影響 本試驗采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）system，是優(yōu)化好的含有酶、dNTP、Mg2＋等成分的2×預混液，按照試劑盒操作說明書進行操作。采用25μL反應體系，其中Premix Ex TaqTM12.5μL，PRRSV上、下游引物各0.5μL，RoxⅡ0.5μL，108拷貝/μL的重組質(zhì)粒1μL；探針濃度依次為0.05μmol；0.1μmol；0.2μmol；0.3 μmol；0.4μmol；0.5μmol 0.5μL，補足水至25μL?；靹蚝筮M行PCR擴增，反應程序按寶生物Premix Ex TaqTM中推薦的程序進行：95℃30s，95℃5s、60℃20s循環(huán)40次。同時設立無模板的陰性對照。

2.3 熒光定量PCR反應標準曲線的建立 利用經(jīng)優(yōu)化后的PRRSV探針濃度，應用相同的反應程序，對10倍系列稀釋的PRRSV陽性標準模板進行擴增，收集熒光數(shù)據(jù)，建立標準曲線。

2.4 熒光定量PCR的敏感性試驗 取以10倍梯度稀釋的標準陽性質(zhì)粒作為模板并用無RNA酶水設陰性對照分析敏感性，以優(yōu)化的反應體系和條件進行熒光定量PCR反應。

2.5 熒光定量PCR的特異性試驗 以PRRSV 108、107、106、105、104拷貝/μL的陽性質(zhì)粒以 及PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV病毒核酸為模板，按照優(yōu)化的條件進行熒光定量PCR檢測，以檢測本方法的特異性。

2.6 熒光定量PCR的重復性試驗 以109、108、107拷貝/μL的重組質(zhì)粒作為標準陽性模板，每個濃度重復3次，按照優(yōu)化的擴增體系進行熒光定量PCR，計算變異系數(shù)（CV%），以評價本方法的準確性和穩(wěn)定性。

2.7 臨床樣品的檢測 采集來自周邊豬場的30份組織樣品，提取RNA，用建立的該方法及常規(guī)PCR法對上述組織樣品進行檢測，同時用細胞培養(yǎng)來進行病毒分離，分離的病毒用普通RT-PCR進行擴增。

3 結(jié) 果

3.1 ORF7基因的擴增、克隆及鑒定結(jié)果 擴增出的ORF7基因RT-PCR產(chǎn)物大小為105bp，與預期結(jié)果相符。擴增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，得到的重組質(zhì)粒命名為pMD-ORF7。經(jīng)雙酶切鑒定，分別切出2690bp和105bp大小的片段結(jié)果與預期結(jié)果一致（圖1）。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中含有PRRSV ORF7基因的部分核苷酸序列。

圖1 PRRSV ORF7基因PCR及雙酶切鑒定圖1，2：PRRSV ORF7基因 PCR 產(chǎn)物；3：pMD-ORF7雙酶切產(chǎn)物；M：DL2000MarkerFig.1 PRRSV ORF7gene PCR and double enzymatic digestion identification1，2：PRRSV ORF7gene PCR product；3：pMDORF7double enzymatic digestion product；M：DL2000Marker

3.2 重組質(zhì)粒濃度的測定 提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)核酸蛋白儀測定，其質(zhì)粒濃度為0.404mg/mL，OD260nm/OD280nm比值為1.83，符合純度要求。經(jīng)計算該陽性重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.51×l012個拷貝/μL。

3.3 探針濃度的優(yōu)化 引物濃度以寶生物Premix Ex TaqTM中推薦的0.2μmol/L為最佳引物濃度，并以相同濃度的核酸為模板的反應體系中，先用不同濃度范圍的探針，進行熒光定量PCR。以循環(huán)Ct值最小，熒光強度增加值（ΔRn）最大為選定原則。經(jīng)優(yōu)選后探針的最佳濃度分別為0.4μmol/L。

3.4 標準曲線的建立 按上述優(yōu)化的反應條件，取109、108、107、106、105、104拷貝/μL的重組質(zhì)粒作為標準陽性模板，分別進行擴增，系統(tǒng)自動分析軟件顯示Ct值與標準陽性模板濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998，PCR擴增效率為97.9%（圖2）。

圖2 濃度為109-104拷貝/μL的PRRSV質(zhì)粒標準品的FQPCR擴增標準曲線Fig.2 Concentration 109-104 copies/μL PRRSV plasmids standard amplification plot of real-time FQ-PCR for PRRSV

3.5 熒光定量PCR的敏感性試驗 對PRRSV陽性標準質(zhì)粒進行10倍稀釋后用熒光定量PCR方法進行檢測，結(jié)果表明質(zhì)粒濃度為3.51拷貝/μL時，仍能出現(xiàn)典型的擴增曲線，顯示出良好的敏感性。

3.6 熒光定量PCR的特異性試驗 PRRSV 3.51×108、3.51×107、3.51×106、3.51×105、3.51×104拷貝/μL 的陽性質(zhì)粒以及 PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV的病毒核酸為模板，用建立的TaqMan熒光定量PCR系統(tǒng)進行檢測。結(jié)果表明除PRRSV模板檢測有擴增曲線外，其余的均為陰性，無任何交叉反應，呈現(xiàn)出良好的特異性。

3.7 熒光定量PCR的重復性試驗 以3.51×109、3.51×108、3.51×107拷貝/μL濃度的質(zhì)粒標準品作3次重復檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值變異系數(shù)分別為0.78%、0.71%、0.78%，表明檢測方法具有較好的穩(wěn)定性（表1）。

表1 FQ-PCR的重復性試驗Tab.1 Repeatability test of real-time FQ-PCR for PRRSV

3.8 臨床樣品的檢測 30份臨床樣品中用本研究中建立的FQ-PCR方法檢測出28份樣品為陽性，而用常規(guī)PCR方法檢測僅有25份為陽性。對常規(guī)PCR檢測為陽性的樣品進行熒光定量PCR檢測也為陽性。對常規(guī)PCR檢測為陰性的5份樣品進行熒光定量PCR檢測，有3份樣品為陽性。病毒分離的結(jié)果則與FQ-PCR法檢測得到的結(jié)果完全一致，說明，建立的方法可以很好的用于臨床樣品的診斷。

4 討 論

PRRSV ORF7編碼核衣殼蛋白，即N蛋白，它是PRRSV最小的結(jié)構(gòu)蛋白，相對的保守，也是免疫原性最強的蛋白，在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20%～40%［9］。N蛋白包括對所有毒株保守的共同表位，又有對美、歐洲型分離株特異的表位。國外，有許多研究者制備了多株N蛋白的單克隆抗體對其抗原表位進行研究，結(jié)果表明歐洲分離株和美洲分離株的N蛋白具有高度保守的抗原表位［10－12］。由于豬感染PRRSV后，動物機體首先產(chǎn)生的是針對N蛋白的抗體，并且抗體在體內(nèi)的存留時間較長，可以根據(jù)N蛋白抗體的水平的高低，對機體的發(fā)病情況和免疫水平做出合理的評價，因此，N蛋白可作為PRRSV抗體檢測的診斷抗原［13］。本研究選用相對保守的N蛋白，建立了檢測PRRSV的TaqMan實時熒光定量PCR方法。試驗結(jié)果顯示，所建立的檢測方法能特異、靈敏地對PRRSV進行快速檢測，為PRRSV的快速診斷方法的研究奠定了基礎。

試驗證實該方法特異性強，不與其他任何病原發(fā)生假陽性反應；靈敏度高，檢測靈敏度可達3.51拷貝/μL。用該方法初步用于臨床疑似病料的檢測中，并與常規(guī)RT-PCR方法進行比較，結(jié)果顯示：與常規(guī)RT-PCR相比較，本試驗所建立的方法不但可以定性檢測PRRSV，還可以定量檢測PRRSV，而且能夠檢測出常規(guī)RT-PCR無法檢測的病料，同時也免去了DNA水平電泳的步驟，更加省時，且操作簡單。因此，該方法具有快速、靈敏、特異、定性、定量等優(yōu)點。

國內(nèi)將熒光定量PCR應用于PRRSV的檢測已有報道。楊宗照等［14］建立了實時熒光定量PCR技術(shù)檢測高致病性PRRSV，該方法能快速、簡便地檢測到HP-PRRSV的存在。楊春華等［15］等建立了檢測PRRSV的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，該方法檢測靈敏度可達10拷貝/μL，并具有良好的特異性和重復性。但這些建立的方法均采用了SYBR Green染料法，該方法雖然在操作中更加簡便，但熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號，從而造成特異性低。而本研究中運用了TaqMan技術(shù)建立了檢測PRRSV的實時熒光PCR，一方面提高了檢測的靈敏度和準確性，另一方面又提高了檢測的特異性。

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