周松峰，廖文軍，覃紹敏，袁書智，白安斌，吳健敏

狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RV）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性人畜共患傳染病。所有溫血動物都可感染，狂犬病一旦發(fā)病，病死率幾乎100%［1］，是人類病死率最高的急性傳染病之一?？袢〔《綠基因編碼的糖蛋白（glycoprotein，GP）是病毒唯一暴露在表面的蛋白［2］，是唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的病毒蛋白［3］，在狂犬病毒致病和免疫中起著關(guān)鍵作用［4］。

狂犬病的診斷方法目前主要有中和試驗、免疫熒光試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）等，但這些檢測方法對儀器和專業(yè)人員的依賴性較高，檢測成本昂貴，且耗時相對較長，極大的限制了它們在基層單位的應(yīng)用，由于我國面積遼闊，農(nóng)村散養(yǎng)犬較多，在開展RV的監(jiān)測及免疫效果評估時，急需建立一種快速、敏感、穩(wěn)定，可以現(xiàn)場使用的檢測方法。

近年來自體紅細(xì)胞凝集試驗發(fā)展迅速［5］，已在多個檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用［6－7］。該方法的基本原理是：以紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，利用基因工程方法構(gòu)建一種重組雙功能融合蛋白（目標(biāo)抗原或抗體與紅細(xì)胞非凝集型抗體［8］聯(lián)結(jié)而形成的抗原－抗體或抗體-抗體結(jié)合物），該融合蛋白既能與紅細(xì)胞結(jié)合又能與被檢抗體/抗原結(jié)合，通過樣品中被檢抗體/抗原的橋聯(lián)作用，使指示紅細(xì)胞發(fā)生凝集，根據(jù)指示紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象達(dá)到快速檢測的目的。

本實驗室利用該技術(shù)成功建立了檢測豬瘟、豬偽狂犬病毒的紅細(xì)胞凝集試驗［9－10］。因此本試驗擬在此基礎(chǔ)上利用（SOE）PCR技術(shù)，將狂犬病毒G基因主要抗原表位區(qū)kg與抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體2E8scFv［11］拼接成雙功能融合基因，進(jìn)行表達(dá)復(fù)性并對表達(dá)蛋白進(jìn)行檢驗，構(gòu)建既能與人紅細(xì)胞結(jié)合，又能與RV抗體反應(yīng)的雙功能融合蛋白。目的是為了進(jìn)一步建立狂犬病毒抗體快速檢測紅細(xì)胞凝集試驗方法。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒、載體、菌株和血清 重組質(zhì)粒pMD-G（含有狂犬病毒G基因主要抗原表位區(qū)）、鼠抗RV高免血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員惠贈；重組質(zhì)粒pMD-2E8scFv（含有抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因）［11］由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所章金剛研究員惠贈；原核表達(dá)載體pET-TrX、表達(dá)菌株BL21（DE3）pLysS均由本實驗室保存；7份RV陽性血清、7份RV陰性血清、犬細(xì)小病毒（CPV）陽性血清、犬瘟熱病毒（CDV）陽性血清均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Kod-plus高保真酶為TOYOBO（日本）產(chǎn)品；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、及TaqDNA 聚合酶均購自 TaKaRa（日本）公司；IPTG購自Promega公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒購自TIANGEN公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG為Beyotime產(chǎn)品；Ni-NTA蛋白純化樹脂為QIAGEN公司產(chǎn)品；氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽均為Sigma公司產(chǎn)品；其它化學(xué)試劑均為南寧（中國）生化藥品儀器公司分析純產(chǎn)品。

1.3 重組PCR引物設(shè)計 根據(jù)重疊延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因與2E8scFv基因序列，設(shè)計4條重組PCR引物 （表1）。其中引物2E8scFv-U/2E8scFv-D用于擴(kuò)增合成2E8scFv基因，引物Kg－U/Kg-D用于擴(kuò)增合成Kg基因。2E8scFv3′末端15個堿基和Kg5′端15個堿基為互補(bǔ)序列（陰影部分）用于基因的拼接，拼接順序為2E8-Kg。2E8scFv-U 和 Kg-D中的下劃線部分為引入的BamH I、EcoR I酶切位點。

表1 2E8scFv、Kg基因引物序列Tab.1 Primers of 2E8scFv and Kg

1.4 2E8Kg融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以2E8scFV-U/2E8scFV-D和 Kg-U/Kg-D為引物，從pMD-2E8scFv和pMD-G重組質(zhì)粒中分別擴(kuò)增融合基因2E8Kg的5′端片段2E8scFv和3′端片段Kg基因。PCR擴(kuò)增條件均為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸70 s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。以純化后的2E8scFv和Kg基因為模板，采用（SOE）PCR方法拼接成2E8Kg融合基因。第一輪PCR反應(yīng)體系為：2E8scFv和 Kg基因各0.5μL、10× Buffer2.5 μL、5U/μL KOD-plus高保真酶0.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL、用滅菌雙蒸水加至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1 min，60℃退火1min，72℃延伸2min，7個循環(huán)。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入引物2E8scFv-U和 Kg-D各0.5μL，然后95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將上述PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及BamH I、EcoR I雙酶切鑒定后送測序公司測序。測序正確后將融合基因2E8kg亞克隆到原核表達(dá)載體pET-Trx中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pETTrx-2E8kg。

1.5 2E8Kg融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將鑒定正確的pET-Trx-2E8Kg原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）pLysS中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳驗證其是否表達(dá)，用Band-Scan軟件測定目的蛋白相對含量。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)菌液，用細(xì)菌洗滌液初步洗滌后，加入細(xì)裂解液作用30min后用細(xì)胞破碎儀菌破碎處理3遍，分別收集沉淀和上清，沉淀用包涵體洗滌液洗滌兩遍后，用包涵體溶解液溶解，將上述溶解液和上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，進(jìn)行可溶性分析。

1.6 2E8Kg融合蛋白的純化與復(fù)性 將誘導(dǎo)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，按上述方法制備包涵體后，采用親和層析法和谷胱甘肽再氧化法對融合蛋白進(jìn)行純化和復(fù)性，復(fù)性24h后，用透析液透析48h，每6h換液一次，透析袋內(nèi)的液體即為純化和復(fù)性后的蛋白。用PEG20000濃縮復(fù)性蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒測定其濃度。

1.7 2E8kg融合蛋白的 Western-blot檢測 將純化后的2E8kg融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上，將膜用封閉液（5%的脫脂奶粉）4℃封閉過夜，用TBST洗滌，一抗加入鼠抗RV高免血清，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物顯色液顯色，邊搖動邊觀察，至條帶清晰后加入雙蒸水終止其反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.8 紅細(xì)胞凝集試驗檢測2E8kg融合蛋白的雙功能生物學(xué)活性 取7份RV陽性血清，同時設(shè)7份RV陰性血清作對照，取96孔血凝板，每孔中加入50μL，然后再向每個孔中依次加入10μL雙功能融合蛋白（1.2mg/mL）和20μL 2%O型人紅細(xì)胞，混勻后靜置30min觀察結(jié)果；分別取A、B、AB型人紅細(xì)胞，按同樣的方法操作，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 2E8Kg融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD-2E8scFv和pMD-G為模板，分別擴(kuò)增出兩條大小分別為732bp和999bp的目的片段，命名為2E8scFv和Kg（如圖1），與預(yù)期擴(kuò)增片段一致。以瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段2E8scFv和Kg為模板，通過（SOE）PCR拼接成2E8Kg融合基因，將其克隆到pMD18-T Simple載體上，鑒定正確后插入原核表達(dá)載體pET-Trx，通過PCR（如圖2）及BamH I、EcoR I雙酶切鑒定后測序，測序結(jié)果表明該片段與融合基因2E8Kg一致，大小為1 731bp且讀碼框正確。表明融合基因和原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 目的基因2E8scFv和Kg的PCR擴(kuò)增圖M：DNA2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：Kg基因；2：2E8scFv基因Fig.1 PCR amplification of 2E8scFv and Kg genesM：DNA Marker 2000；1：Kg gene；2：2E8scFv gene

圖2 融合基因2E8Kg的SOE-PCR擴(kuò)增圖M.DNA2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.2E8Kg融合基因Fig.2 Amplification of 2E8Kg fusion gene by SOE-PCRM：DNA Marker 2000；1：2E8Kg fusion gene

2.2 2E8Kg融合蛋白的表達(dá)、可溶性分析、復(fù)性及純化 取pET-Trx-2E8Kg陽性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時設(shè)pET-Trx空載體轉(zhuǎn)化菌為對照，結(jié)果在37℃，IPTG 濃度為0.7mmol/L，誘導(dǎo)3h時獲得最大表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白總量23.5%左右。SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶的包涵體形式存在，相對分子質(zhì)量約77.7kD（如圖3），與預(yù)期蛋白分子大小一致。利用親和層析法對變性溶解的目的蛋白進(jìn)行純化并用BandScan生物學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明目的蛋白洗脫后的純度提高到了98.9%（圖略）。BCA蛋白定量試劑盒測定復(fù)性濃縮后蛋白含量約為1.7mg/mL。

圖3 pET-Trx-2E8Kg重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳的結(jié)果M.低分子量蛋白marker；1.空載體對照；2.誘導(dǎo)后重組菌蛋白Fig.3 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by SDS-PAGEM：Protein MW marker；1：Negative control；2：Recombinant bacteria protein after induction

2.3 2E8Kg融合蛋白 Western-blot檢測 用RV高免血清對2E8Kg融合蛋白進(jìn)行 Western-blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約在77.7kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶，而同時用CPV和CDV陽性血清對2E8Kg融合蛋白進(jìn)行Western-blot檢測，結(jié)果無任何免疫印跡條帶出現(xiàn)（圖4），說明2E8kg融合蛋白能夠與RV高免血清發(fā)生特異反應(yīng)，具有良好的免疫反應(yīng)原性。

2.4 紅細(xì)胞凝集試驗檢測2E8Kg融合蛋白的生物學(xué)活性 用純化和復(fù)性后的2E8Kg融合蛋白、2%人“O”型紅細(xì)胞、7份RV陰、陽性血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗，結(jié)果7份RV陽性血清均可觀察到強(qiáng)凝集現(xiàn)象（圖5），而7份RV陰性血清未觀察到凝集現(xiàn)象（圖6）。用血型定型試劑盒篩選出A、B和AB型人紅細(xì)胞與RV陽性血清進(jìn)行同樣的試驗，結(jié)果也觀察到強(qiáng)凝集現(xiàn)象（圖7）。用CPV，CDV陽性血清分別與2E8Kg融合蛋白作用，結(jié)果未發(fā)生凝集（圖8）。上述結(jié)果說明2E8Kg融合蛋白不但能夠與RV高免血清發(fā)生特異反應(yīng)，而且能與人紅細(xì)胞結(jié)合（無血型限制），具有雙功能特性。

圖4 pET-Trx-2E8Kg重組菌表達(dá)產(chǎn)物的 Western-blot鑒定M.低分子量蛋白 marker；a.空載體對照；b.誘導(dǎo)后pET-Trx-2E8Kg重組菌蛋白；c.CPV陽性血清陰性對照；d.CDV陽性血清陰性對照。Fig.4 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by Western-blotM：Protein MW marker；a：Negative control；b：Recombinant bacteria pET-Trx-2E8Kg protein after induction；c：Negative control of CPV positive serum；d：Negative control of CDV positive serum

圖5 狂犬病毒陽性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗Fig.5 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV positive serum，and O type human red blood cells；

圖6 狂犬病毒陰性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗Fig.6 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV negative serum，and O type human red blood cells；

圖7 狂犬病毒陽性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗Fig.7 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV positive serum，and human red blood cells；

圖8 犬不同病毒陽性血清與2E8Kg雙功能融合蛋白及人O型紅細(xì)胞的紅細(xì)胞凝集試驗Fig.8 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，different virus－positive serum of dog，and O type human red blood cells.

3 討 論

狂犬病是人畜共患的自然疫源性傳染病，目前尚無有效的治療方法，疫苗免疫預(yù)防狂犬病的發(fā)生尤其重要［12］。我國狂犬病發(fā)病死亡人數(shù)位居重點傳染病死亡數(shù)和病死率榜首，易感動物發(fā)病呈逐年上升的趨勢，要徹底根除狂犬病，首先就必須消滅動物的狂犬病，特別是隱性帶毒動物及野生動物的狂犬病。針對狂犬病的現(xiàn)狀，如何利用有效的診斷方法對隱性帶毒動物快速診斷，對狂犬病疫苗免疫后的動物進(jìn)行抗體監(jiān)測及免疫效果評估，是保證人和動物安全的當(dāng)務(wù)之急。

目前，狂犬病現(xiàn)有的診斷方法對儀器和專業(yè)人員的要求較高，檢測成本昂貴，且耗時相對較長，因而極大的限制了它們在基層單位的使用。從而導(dǎo)致動物狂犬病免疫效果評估的工作開展較為困難，這對控制和消滅動物狂犬病十分不利。自體紅細(xì)胞凝集試驗以其快速、簡便、不需要任何儀器，僅憑肉眼就可以觀察結(jié)果的特點在人類疾病快速診斷中得到了較好的應(yīng)用。由于犬紅細(xì)胞表面抗原十分復(fù)雜，要尋找到各類血型的共有抗原十分困難，為此，本研究借助表面抗原背景清楚的人紅細(xì)胞作為指示劑建立檢測動物病原抗體的紅細(xì)胞凝集實驗方法。

由于本實驗拼接的融合基因長度較長，在初步PCR擴(kuò)增和拼接的過程中，發(fā)生了基因突變，1 237位堿基由A突變?yōu)門，形成了一個終止密碼子TGA，無法正確表達(dá)此融合蛋白。為此改用Kodplus高保真酶對其進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果測序沒有發(fā)生堿基的突變。構(gòu)建原核表達(dá)體系一般需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件。本試驗在融合蛋白表達(dá)的過程中嘗試了多種可溶性原核表達(dá)載體，都沒有得到相應(yīng)的可溶性表達(dá)或表達(dá)量太低。在經(jīng)過表達(dá)誘導(dǎo)條件的篩選、優(yōu)化后，最后選取原核表達(dá)載體pET-Trx，在37℃，IPTG濃度為0.7mmol/L，誘導(dǎo)3h時獲得較高的表達(dá)。由于表達(dá)產(chǎn)物以不溶的包涵體形式存在，該融合蛋白需要經(jīng)過復(fù)雜的包涵體溶解、變性、復(fù)性過程，這極大的影響了融合蛋白的生物學(xué)活性，導(dǎo)致在目前建立的紅細(xì)胞凝集試驗過程中出現(xiàn)凝集的時間較長，與人血型檢測的速度相比仍有一定的差距，估計與2E8kKg雙功能融合蛋白生物學(xué)活性不高有關(guān)。為此本試驗擬從以下3個方面進(jìn)行研究，一是篩選不同的宿主菌株；二是在2E8scFv與RV-Kg基因兩個功能區(qū)之間引入一個連接肽，以克服因直接拼接，造成兩個功能區(qū)相互遮掩而導(dǎo)致活性下降的可能。三是繼續(xù)尋找新的可溶性表達(dá)系統(tǒng)及可溶性表達(dá)條件，達(dá)到獲得雙功能融合蛋白的可溶性表達(dá)，減少因包涵體變性、復(fù)性造成活性降低的目的。

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