鐘志軍，徐 杰，于 爽，王玉飛，周冬生，喬 鳳，曲 勍，汪舟佳，杜昕穎，陳燕芬，黃克和，馬曉平，陳澤良，彭廣能

布魯氏菌病（Brucellosis，簡稱布?。┦且环N危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病，在我國被列為法定報告的疾病之一。布魯氏菌是布病的病原體，能感染包括人在內(nèi)的多種動物，動物感染后主要表現(xiàn)為流產(chǎn)或不育，而人感染后主要表現(xiàn)為波浪熱，嚴(yán)重者喪失勞動力。布魯氏菌疫苗的研究和應(yīng)用，對于人類和動物布病的預(yù)防和最終消滅布病具有重要作用。

布魯氏菌減毒活疫苗是通過毒力變異、人工選擇或從自然界直接篩選而獲得的減毒或無毒菌株。由于減毒活疫苗菌株能在宿主體內(nèi)短暫生長和增殖，延長了免疫系統(tǒng)對抗原識別時間，有利于提高免疫能力和記憶型免疫細(xì)胞生成，所以減毒活疫苗疫苗具有免疫效果好，免疫力持久等優(yōu)點［1］。由于減毒活疫苗致弱的遺傳基礎(chǔ)不清楚，對減毒活疫苗安全性沒有一個科學(xué)的評價，因此減毒活疫苗也有毒力回復(fù)的潛在危險。因此，了解減毒活疫苗菌株DNA水平上的變化，將有助于了解其致弱機(jī)理和評價其毒力特性。當(dāng)前國際上廣泛用于動物布魯氏菌病預(yù)防的減毒活疫苗包括S19、RB51和 Rev.1［2］。在我國，除了國際上通用的疫苗株S19外，廣泛使用的疫苗株還包括104M、M5和S2，其中S19、M5和S2分別用于預(yù)防牛、羊和豬的布魯氏菌病的預(yù)防，而104M被廣泛用于人群布病預(yù)防［3］。本研究將布魯氏菌全基因組芯片應(yīng)用于減毒活疫苗株比較基因組分析，鑒定疫苗株中缺失的基因，獲得它們的基因缺失譜，了解減毒活疫苗基因構(gòu)成，從而為了解減毒活疫苗株的致弱機(jī)理以及改造布魯氏菌減毒活疫苗株和研發(fā)新的減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和試劑 4株減毒活疫苗株（104M，M5，S19和S2）為本室保存。大豆胰蛋白胨瓊脂（TSA）和大豆胰蛋白胨肉湯（TSB）購自生物梅里埃公司，用于培養(yǎng)布魯氏菌。

1.2 試驗菌株DNA提取 采用Promega的Wizard?Genomic DNA Purification Kit進(jìn)行提取。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。用紫外分光光度計（Beckman DU 600）測定獲得的基因組DNA吸光度值，確定DNA濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 比較基因組雜交和芯片數(shù)據(jù)分析 布魯氏菌全基因組DNA芯片由本室構(gòu)建，芯片雜交和數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)進(jìn)行［4］。

1.4 基因缺失和拷貝增多鑒定 首先將芯片中各樣點信號比值（待測DNA歸一化強(qiáng)度/參照DNA歸一化強(qiáng)度）轉(zhuǎn)換成log2值后，以-1為Cutoff值鑒定基因缺失，即如果某個基因熒光比值小于-1，那么該基因在相應(yīng)菌株基因組中缺失。以0.65為Cutoff值鑒定基因拷貝數(shù)增多事件，即如果某個基因熒光比值大于0.65，那么該基因在相應(yīng)菌株基因組中拷貝數(shù)增多。確定Cutoff值依據(jù)來源于16M菌DNA＋參照DNA、544A菌DNA＋參照DNA、參照DNA＋參照DNA的芯片雜交結(jié)果。與16M菌相比，牛型544A菌的基因組中多出了2個染色體基因組簇（BruAb1＿0609-BruAb1＿0613和BruAb2＿0590-BruAb2＿0596）。在芯片雜交過程中，參照DNA是16M菌和牛544A菌基因組DNA的等量混合物。因此這2個染色體基因組簇，在牛型544A菌DNA中含量是參照DNA的兩倍，這恰恰就是基因拷貝數(shù)增多的依據(jù)。我們根據(jù)2個染色體基因組簇在上述三種雜交組合中的熒光信號比值，確定了0.65作為鑒定基因拷貝增多的Cutoff值。最終根據(jù)芯片雜交結(jié)果，鑒定各個菌株中出現(xiàn)的基因缺失和基因拷貝數(shù)增多的分子事件。

1.5 芯片結(jié)果PCR驗證 針對芯片中顯示缺失的基因，利用芯片研制過程中每個基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗證芯片中顯示缺失的基因是否真實。缺失基因中單個基因缺失，采用單個基因引物驗證，缺失片段驗證則在片段中挑出2個具代表性的基因進(jìn)行驗證（具體基因略）。PCR反應(yīng)體系為25μL，PCR體系如下：50mmol/L 的 KCl，10 mmol/L 的 Tris-HCl（pH 8.0），2.5mmol/L MgCl2，0.001%明膠，0.1%BSA，150μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.6μmol/L引物，1U Taq DNA聚合酶 （MBI Fermentas）和10ng模板DNA。PCR反應(yīng)于96孔板中進(jìn)行，DNA熱循環(huán)儀運行參數(shù)：預(yù)變性95℃ 5min，94℃ 1min、58℃1min、72℃ 1.5min共30個循環(huán)，最后72℃10 min。然后取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖膠電泳檢測，判定芯片中顯示缺失基因的真實性。

1.6 缺失基因功能分析 調(diào)用布魯氏菌基因庫中基因的功能信息，將缺失基因功能根據(jù)COG進(jìn)行分 類 （http：//www.phidias.us/bbp/data/index.php），分析這些差異基因的功能信息。

2 結(jié) 果

2.1 菌株104M差異基因分析 我們利用研制的布魯氏菌全基因組DNA芯片對104M進(jìn)行了雜交分析。結(jié)果表明，104M菌株中共缺失27個基因，主要包括 BMEI1661-1662，BMEII0717，BMEII0827-0849，BMEII1016。這些缺失的基因和在牛種發(fā)現(xiàn)的缺失基本一致，表明和其親本株在基因組構(gòu)成上基本一致。同時我們也對該菌株中多拷貝基因的情況進(jìn)行了分析，多拷貝的基因主要包括BruAb1＿0610-0612，BruAb1＿1831-1832，BruAb2＿0591-596等。

2.2 疫苗株M5差異基因分析芯片結(jié)果顯示，僅有6個基因在M5菌株中發(fā)生了缺失，它們是BruAb2＿0595，BruAb1＿0414，BruAb2＿068，BruAb2＿0326和BMEI1661-1662。鑒定到的多拷貝基因主要包括 BMEI0926-929，BMEII0717，BMEII0827-849，BMEII1016，BruAb1＿0609-613，BruAb1＿1831-1832，BruAb2＿0593-596等大片段，提示疫苗株在選育過程中，很多基因發(fā)生了多拷貝變化。

表1 COG分類原則代碼表Tab.1 Information of COG codes

圖1 疫苗株104M菌株雜交的信號比值Fig.1 The hybridization signal with reference and vaccine 104MDNA samples

2.3 疫苗株S2差異基因分析芯片結(jié)果表明，S2菌株中缺失基因共21個，分別為BMEI0801，BMEI0900，BMEI1128，BMEI1661-1662，BMEI1674-1667和BMEI1686-1702。這些缺失基因中，有部分同犬種菌中缺失基因一致，說明其與犬種菌在基因組構(gòu)成上有一定相似性。多拷貝基因主要包括BMEI0929， BMEII0717， BMEII0827-849，BMEII1016，BruAb1＿0609-613，BruAb1＿1831-1832，BruAb2＿0593-596。

圖2 疫苗株M5菌株雜交的信號比值Fig.2 The hybridization signal with reference and vaccine M5DNA samples

圖3 疫苗株S2菌株雜交信號比值Fig.3 The hybridization signal with reference and vaccine S2 DNA samples

2.4 疫苗株S19差異基因分析 S19菌株中鑒定到的缺失基因共有33個，它們主要包括BMEI0762，BMEI0926，BMEI0929，BMEI1128，BMEI1661-1662，BMEI1934-1935， BMEII0717，BMEII0827-0849，BMEII1016。鑒定到的一些多拷貝的基因包括 BruAb1＿0609-613，BruAb1＿1831-1832，BruAb2＿0593-596等。

2.5 芯片結(jié)果PCR驗證 為了減少芯片結(jié)果中的假陽性，保證芯片結(jié)果中相應(yīng)缺失基因真實可靠，我們采用PCR進(jìn)行缺失基因驗證。如圖5所示，對這些缺失基因的驗證過程中，我們發(fā)現(xiàn)部分缺失基因在相應(yīng)菌株中并沒有缺失。4株疫苗株中共發(fā)現(xiàn)有4個基因在芯片中顯示為缺失，但PCR驗證卻沒有發(fā)現(xiàn)缺失。說明芯片結(jié)果中存在部分假陽性，因此對缺失基因的驗證是必要的步驟。

圖5 PCR驗證相應(yīng)疫苗菌株中缺失基因擴(kuò)增圖Fig.5 Verification on results of deletion genes in the vaccine strains by PCR

2.6 疫苗株缺失基因數(shù)目分布情況分析 芯片結(jié)果進(jìn)行PCR驗證后，我們分析了4株疫苗菌株中缺失基因的數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)S19缺失的基因數(shù)目最多，其次是104M和S2，而 M5中缺失基因數(shù)目最少。

圖6 4株疫苗菌株中缺失基因數(shù)目分布Fig.6 Total number of deletion genes for each of these four vaccine strains

2.7 缺失基因功能分類 我們根據(jù)COG分類原則，對芯片結(jié)果中顯示為缺失的基因進(jìn)行了更細(xì)致的歸類，深入分析這些缺失基因。

如圖7所示，4株減毒活疫苗株缺失基因功能主要為胞內(nèi)活動有關(guān)基因和功能未知基因（分別為31和45個）。其中104株減毒活疫苗株的缺失基因功能主要分布在胞內(nèi)活動有關(guān)的基因和功能未知基因中（分別為14和12個），而M5和S2減毒活疫苗株缺失基因主要是一些功能未知的基因（3個和15個）。S19減毒活疫苗株缺失的基因功能類型較其他3株的功能較復(fù)雜，胞內(nèi)活動有關(guān)的基因有14個，代謝有關(guān)的基因有6個，功能未知基因有14個。

圖7 依據(jù)COG原則對4株減毒活疫苗株的缺失基因功能分類圖Fig.7 Function of the deletion genes in these four vaccine strains

3 討 論

目前我國國內(nèi)主要應(yīng)用的疫苗株包括104M、M5、S2以及S19。104M由前蘇聯(lián)分離，具典型牛種1型布魯氏菌特性，有一定殘余毒力。我國引進(jìn)該菌種后進(jìn)行了系統(tǒng)研究，證明對人群預(yù)防布病感染安全有效［5］。但本疫苗在多次接種后能使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為局部皮試敏感性增高及出現(xiàn)某些臨床癥狀，且隨接種次數(shù)的增加而增加，說明其作為人用疫苗仍存在風(fēng)險。羊種布魯氏菌五號菌種（簡稱M5），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所用羊種強(qiáng)毒株傳代培育出的弱毒疫苗。特點是免疫性好，殘余毒力低，被接種動物的血清凝集消失快。對非懷孕牛，羊，鹿注射均很安全，給泌乳牛接種，產(chǎn)奶量略有下降，給孕畜注射可引起部分流產(chǎn)，對非孕畜毒力穩(wěn)定［6］。豬種布魯氏菌二號菌種（簡稱S2菌）由中國獸藥監(jiān)察所選育，具有作用范圍廣和使用方便等特點，可作為皮下注射，肌肉注射或氣霧和口服等多種形式接種，但最適宜做口服免疫接種。S19由美國Buck自奶牛中分離［7］。剛分離時毒力很強(qiáng)，在實驗室保存多年后毒力自行變?nèi)?，成為一株毒力穩(wěn)定的弱毒疫苗。S19菌苗對犢牛和綿羊是安全的，對山羊的反應(yīng)較重，給乳牛注射后產(chǎn)奶量下降，一周左右恢復(fù)正常，給孕畜注射可引起流產(chǎn)。

在布魯氏菌減毒活疫苗研制過程中，一般采用在人工培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，人工培養(yǎng)基提供的條件將大大緩解細(xì)菌在宿主體內(nèi)面對的代謝壓力。根據(jù)細(xì)菌基因組簡約進(jìn)化理論，對細(xì)菌生存非必須基因就可能在適應(yīng)環(huán)境中丟失而造成基因缺失。到目前為止，我們對疫苗株致弱的分子機(jī)制還不清楚。目前研究相對較多的是S19疫苗株。S19是第一株測序的疫苗株［8］。通過比較S19株基因序列和野生毒株中的兩條染色體發(fā)現(xiàn)，只有45個ORF與毒株存在差異。這些差異包括了4個大于60bp的基因差異。我們的芯片雜交結(jié)果表明，S19疫苗株和16M相比，缺失了30個基因。這些缺失基因和牛種布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)的缺失基因一致，說明S19疫苗株在基因構(gòu)成上基本和親本株一致。已有研究通過突變和動物模型來鑒定這些差異基因，幫助解釋S19致弱的基因構(gòu)成成因［9］。芯片結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)疫苗株S19缺失2個獨特的 ORFs（BMEI1934-1935），這兩個基因在其他菌株中沒有缺失，說明這兩個基因有可能在疫苗株S19致弱中起關(guān)鍵作用，可以通過對野毒株缺失該基因進(jìn)行進(jìn)一步驗證。我們還發(fā)現(xiàn)了一些基因 （BruAb1＿0609-613，BruAb1＿1831-1832，BruAb2＿0593-596）在S19中以多拷貝形式存在，這些缺失和多拷貝基因差異都可能是其致弱的原因。這些差異中包含了一個蛋白基因的缺失，這個基因的結(jié)構(gòu)與小腸結(jié)腸炎耶爾森（氏）菌YadA和Hia毒力基因以及流感嗜血桿菌中缺失的eryC和eryD相似［10］。然而eryC和eryD在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)并不是毒力必須基因［9］。除了這些差異外，我們還發(fā)現(xiàn)一些可能與減毒有關(guān)，包括脂質(zhì)運輸，代謝，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，傳遞蛋白，外膜蛋白和其他假想蛋白。通過突變和動物模型來鑒定這些差異基因能幫助解釋S19致弱的基因遺傳成因。同時其它活疫苗株基因組測序的完成，將有助于進(jìn)一步分析疫苗株致弱的分子機(jī)制。此外，已有研究表明S2對豚鼠毒力比S19略高，比104M弱［11］。對試驗動物的毒力因動物種類而不同。對豚鼠和恒河猴毒力羊種強(qiáng)毒株比S2高。S2以500億活菌量給懷孕母豬皮下注射不引起流產(chǎn)，以大于常規(guī)50倍量給懷孕綿羊飲水也不引起流產(chǎn)，而且在分娩后不能從羊羔，胎盤，初乳和母羊體內(nèi)實質(zhì)臟器和淋巴結(jié)分離出S2菌。

本課題組除了對4株疫苗株進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，還對19株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了分析。根據(jù)芯片雜交結(jié)果，鑒定出25個差異片段，其中有4個差異片段在4株減毒活疫苗株中缺失。4株減毒活疫苗株中共同缺失了 DFR06（BMEI1661-1662），這個區(qū)段可以作為分子靶標(biāo)進(jìn)行疫苗株和自然感染株的區(qū)分。104M和S19共同缺失了DFR19（BMEII0827-0849），而S19還缺失了 DFR10（BMEI1934-1935），S2缺失了DFR08（BMEI1674-1702）。同時S2還缺失了BMEI1128，這個基因在其他種中都沒有發(fā)現(xiàn)缺失。DFRs的缺失或獲得是自然選擇壓力下的分子進(jìn)化事件，構(gòu)成了布魯氏菌自然種群在自然疫源地中適應(yīng)性演化的遺傳基礎(chǔ)。我們通過對4株疫苗株進(jìn)行比較基因組分析時還發(fā)現(xiàn)有基因拷貝增多的情況。4株疫苗株在BruAb1＿0609-BruAb1＿0613，BruAb1＿1831-1832，BruAb2＿0591-0596等大片段以多拷貝形式存在于基因組中。而S2和M5中還發(fā)現(xiàn)BMEII0827-0849以多拷貝形式存在于基因組中，這個片段在豬種和羊種中也發(fā)現(xiàn)，說明這些多拷貝事件的發(fā)生可能是其功能改變的動因。此外，在分析這4株疫苗株缺失基因數(shù)量時，發(fā)現(xiàn)缺失基因數(shù)目的多少并不能反映其毒力差異，S2菌株對豚鼠毒力比S19略高，但卻比104M菌株弱，就很好地說明了這一觀點。另一方面，M5是通過人工連續(xù)傳代獲得。我們知道，通過體外連續(xù)傳代獲得的致弱菌株，主要通過點突變積累而發(fā)生致弱。因此可以推測M5疫苗株致弱機(jī)理主要由點突變引起，而點突變在芯片中并不能反映出來，所以芯片結(jié)果中發(fā)現(xiàn)M5中缺失基因數(shù)相對較少。

布魯氏菌活疫苗株的使用大大降低人間布病的發(fā)病率，但目前應(yīng)用的幾株動物疫苗株仍存在副作用大和免疫原性不穩(wěn)定等問題。即便是同一系列活菌苗，只要來源、保種和生產(chǎn)方法不同，在表型和使用效果上就存在很大差異。不同疫苗株基因組中鑒定了基因缺失和基因多拷貝的分子事件，揭示了不同來源的疫苗株在基因組組成上的差異，構(gòu)成了不同疫苗株表型與使用效果具有差異性的遺傳基礎(chǔ)?；蚪M中大量功能基因的缺失能夠降低活疫苗株的致病性風(fēng)險，但必然造成疫苗株對宿主動物和人體適應(yīng)力降低，甚至?xí)档推浔Ｗo(hù)力（尤其是缺失一些編碼毒力因子相關(guān)的基因）［12］。本研究通過布魯氏菌全基因組DNA芯片的比較基因組學(xué)技術(shù)，檢測了4株疫苗株的基因缺失和基因多拷貝分子事件，較深入地認(rèn)識了布魯氏菌減毒活疫苗株免疫原性和保護(hù)力的遺傳基礎(chǔ)。另外，利用布魯氏菌全基因組DNA芯片進(jìn)行比較基因組雜交，可以高通量檢測分析活疫苗的毒力基因和抗原蛋白基因，從而可以對任何一株新的布魯氏菌減毒活疫苗株進(jìn)行預(yù)評價。目前已有13株布魯氏菌全基因組序列可用［13］。本課題組正在利用生物信息學(xué)分析它們之間的基因序列差異，希望通過已測序菌株找到一些分子靶標(biāo)和我們發(fā)現(xiàn)的差異基因片段，構(gòu)建囊括13株菌序列的主要差異基因，更深入地研究布魯氏菌活疫苗株以及各亞種內(nèi)的遺傳差異，分析它們在毒力和宿主特異性的遺傳基礎(chǔ)。

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