占義軍，鄧 濤，李紅艷，萬新月，皮小雨

武漢大學人民醫(yī)院消化內科，湖北武漢430060

Zebularine(Zeb)，［1-(β-D-呋喃核糖苷)-1，2-二氫嘧啶-2-酮］，是一種新型的DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑制劑，通過逆轉抑癌基因CpG島的甲基化狀態(tài)從而使抑癌基因重新表達，恢復細胞的抑癌功能。Zeb對腫瘤細胞具有高選擇性，對正常細胞毒性作用很?。?-2］。丁酸鈉(sodium butyrate)是一種組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)，通過抑制組蛋白去乙?；高M而使細胞組蛋白保持高水平的乙?；癄顟B(tài)，誘導被沉默的抑癌基因重新表達。研究發(fā)現結腸癌的發(fā)生與DNA甲基化和組蛋白去乙?；嘘P系［3］。P16基因是一種多腫瘤抑癌基因，啟動子高甲基化是其失活的重要方式［4］。本研究通過探究Zeb和丁酸鈉對結腸癌LOVO細胞增殖和凋亡以及P16基因表達的影響，以期尋求高效、低副作用的聯合抗結腸癌方案。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與器材 結腸癌LOVO細胞購自武漢大學細胞典藏庫;Zeb和丁酸鈉購自美國Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司;MTT試劑盒購自啟動子生物公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自砝碼生物公司;Trizol購自Invitrogen公司;RT試劑盒購自Toyobo公司;PCR試劑盒購自Fermentas公司。

1.2 試劑配制 Zebularine和丁酸鈉分別溶于PBS和RPMI-1640培養(yǎng)液，分別配成 5 mmol/L和100 mmol/L母液，用微孔濾膜除菌，-20℃保存，使用時用RPMI-1640配制成工作液。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組 人結腸癌LOVO細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)。將LOVO細胞分為對照組、Zebularine組、丁酸鈉組、Zebularine+丁酸鈉組。

1.4 MTT法檢測Zeb和丁酸鈉對結腸癌細胞增殖的影響 取對數生長期細胞，20 000個/孔接種于96孔板，每孔加入200 μL培養(yǎng)液，待細胞帖壁后分別用50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L 的 Zebularine和2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L的丁酸鈉處理LOVO細胞24 h、48 h、72 h，每個濃度設4個復孔，藥物作用結束后棄培養(yǎng)液，加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，37℃孵育4 h后于酶標儀490 nm讀取吸光值(A值)，不加藥物處理的細胞為陰性組，未接種細胞只加培養(yǎng)基的孔為空白組。按公式1-(實驗組A值-空白組A值)/(陰性組A值-空白組A值)計算相對抑制率。并計算Zebularine和丁酸鈉24 h、48 h、72 h的半抑制濃度(IC50)。取Zebularine和丁酸鈉72 h IC50作為聯合用藥濃度(下同)，檢測Zebularine+丁酸鈉處理LOVO細胞24 h、48 h、72 h后的抑制率。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞接種于6孔板，分別用145.5 μmol/L的Zebularine、4.3 mmol/L的丁酸鈉、Zebularine+丁酸鈉處理細胞72 h后收集細胞，PBS洗2次，將細胞重懸于500 μL緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混勻后避光孵育10 min后上機檢測。重復3次，取平均值。

1.6 RT-PCR檢測藥物處理后細胞的P16基因的表達 將細胞接種于6孔板，實驗分組如前，培養(yǎng)細胞48 h后收集細胞，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度儀測RNA純度和濃度，按RT試劑盒操作說明合成cDNA，取cDNA進行PCR擴增，引物序列和PCR產物長度:P16 F:5'-CTTCCTGGACACGCTGGT-3'，R:5'-GCATGGTTACTGCCTCTGGT-3'，長度:162 bp;β-actin F:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，R:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'，長 度:240bp。PCR反應條件:94℃ 4 min;94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 25 s;30個周期，72℃ 4 min。取5 μL PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)測得各組條帶的灰度值，重復3次。目的基因與內參的灰度比值代表目的基因的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0軟件包對數據進行處理，所得數據以±s表示，各組變量比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Zeb和丁酸鈉對LOVO細胞增殖的影響 MTT檢測發(fā)現Zebularine(50～500 μmol/L)和丁酸鈉(2～10 mmol/L)對LOVO細胞的增殖具有抑制作用，呈時間和濃度依賴性(見表1、2;圖1、2)。計算Zebularine和丁酸鈉對LOVO細胞的72 h IC50，結果為分別為145.5 μmol/L 和 4.3 mmol/L。使用 145.5 μmol/L 的Zebularine和4.3 mmol/L的丁酸鈉聯合作用于LOVO細胞24 h、48 h、72 h，檢測 LOVO 細胞生長抑制率，結果顯示各個處理時間的聯合用藥組細胞生長抑制率顯著高于陰性對照組和單獨用藥組(見圖3)。

表1 Zeb對結腸癌LOVO細胞增殖的影響Tab 1 Effect of Zebularine on cell growth in human colon cancer cell line LOVO

表2 丁酸鈉對結腸癌LOVO細胞增殖的影響Tab 2 Effect of sodium butyrate on cell growth in human colon cancer cell line LOVO

圖1 Zebularine對LOVO細胞抑制率;圖2 丁酸鈉對LOVO細胞抑制率;圖3 Zebularine聯合丁酸鈉對LOVO細胞抑制率Fig 1 The inhibition rate of Zebularine to LOVO cell;Fig 2 The inhibition rate of sodium butyrate to LOVO cell;Fig 3 The inhibition fate of Zebularine+sodium butyrate to LOVO cell

2.2 Zeb和丁酸鈉對LOVO細胞凋亡的影響 分別使用Zebularine、丁酸鈉、Zebularine+丁酸鈉處理LOVO細胞48 h后，凋亡率分別為10.2% ±1.3%、12.1 % ±1.5%、25.8% ±2.3%。各組凋亡率與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Zeb組與丁酸鈉組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而聯合組與Zeb組和丁酸鈉組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖 4)。

圖4 Zebularine和丁酸鈉對LOVO細胞凋亡的影響 A:對照組;B:Zebularine組;C:丁酸鈉組;D:Zebularine+丁酸鈉組Fig 4 The effect of Zebularine+sodium butyrate to the apoptosis of LOVO cellA:Control group;B:Zebularine group;C:Sodium butyrate group;D:Zebularine+sodium butyrate group

2.3 Zeb和丁酸鈉對LOVO細胞P16基因mRNA表達的影響 陰性對照組表達P16 mRNA微弱，Zeb和丁酸鈉單獨處理LOVO細胞后P16基因表達上調，Zeb和丁酸鈉聯合處理細胞后P16基因mRNA表達明顯增強(見圖5)。陰性對照組、Zebularine組、丁酸鈉組、聯合用藥組的相對表達量分別為:0.423±0.051、0.745±0.076、0.756±0.065、0.930±0.088。經單因素方差分析各組之間的差異，發(fā)現單獨用藥組與陰性對照組表達量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，聯合用藥與單獨用藥組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而單獨用藥組之間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見圖5)。

3 討論

近年來，表觀遺傳學在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療研究中越來越受到重視。一般來說，表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的調控［5］。通過藥物改變DNA甲基化和組蛋白乙?；癄顟B(tài)是改變表觀遺傳以達到抗腫瘤作用的重要策略。

目前已經發(fā)現多種DNA甲基轉移酶抑制劑具有抗腫瘤作用，最重要的是胞苷類似物，如5-氮雜胞苷(5-Azacytidine)、5-雜氮-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)。胞苷類似物對結腸癌細胞有明顯的抑制作用［6］，然而胞苷類似物對腫瘤細胞選擇性差，用于人體產生明顯的毒副效應［7］。Zeb是一種新型的DNA轉甲基酶抑制劑，其對腫瘤細胞具有良好的選擇性［8］。然而Zeb的去甲基化效能較低，單獨應用5-Aza-CdR的去甲基化作用要比Zeb強10～100倍［1］。組蛋白修飾效應主要表現為組蛋白的乙酰化，組蛋白的乙?；癄顟B(tài)使組蛋白與DNA結合疏松，有利于基因的表達，而去乙?；癄顟B(tài)則使許多基因沉默，其中包括很多抑癌基因。丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸類去乙酰化酶抑制劑(HDACi)，在許多腫瘤中表現出抑癌作用，它對正常細胞毒性作用很低。

圖5 Zebularine和丁酸鈉處理LOVO細胞后P16 mRAN的表達Fig 5 The effect of Zebularine and sodium butyrate to the expression of P16 mRNA M:marker;1:Control;2:Zebularine group;3:Sodium butyrate group;4:Zebularine+sodium butyrate group

本研究將Zeb和丁酸鈉作用于結腸癌LOVO細胞，發(fā)現單獨用藥時對腫瘤細胞的抑制率較低，而低濃度的兩種藥物聯用時表現出很好的協(xié)同作用，對腫瘤細胞有很高的抑制率。在凋亡檢測時我們也發(fā)現聯合用藥時細胞凋亡率比單獨用藥時明顯增高。

在RT-PCR檢測P16 mRNA表達時我們發(fā)現陰性照組表達P16 mRNA微弱，Zeb和丁酸鈉處理后細胞重新表達P16 mRNA，表達量為分別為0.745±0.076和0.756±0.065，而Zeb和丁酸鈉聯合作用于細胞后表達量明顯增加，相對表達量為0.930±0.088。P16基因是一種多腫瘤抑制基因，P16的缺失存在于多種腫瘤組織和腫瘤細胞株中。結直腸癌組織中也見P16基因由于異常甲基化而導致失活［9］。P16蛋白通過抑制細胞周期依賴激酶(CDKs)對細胞周期產生影響，產生細胞周期阻滯作用，進而誘導癌細胞分化、凋亡。研究發(fā)現P16基因的失活方式主要是啟動子高甲基化和純合性缺失［4］。本研究發(fā)現Zeb和丁酸鈉都可以使P16基因重新表達，Zeb和丁酸鈉聯合作用于LOVO細胞時，P16基因表達明顯增強，這表明Zeb和丁酸鈉在促進P16基因的表達上具有明顯的協(xié)同作用。最近的研究表明HDACi具有去甲基化作用［10］，因此，Zeb和丁酸鈉可能通過共同的DNA去甲基化作用促進P16基因的表達。我們進行的MTT和凋亡檢測時也發(fā)現Zebularine和丁酸鈉聯用時對LOVO細胞有明顯的增殖抑制和促進凋亡作用，P16基因表達的增強在其中起到一定的作用，但其中可能有多種基因和機制的參與。同時我們發(fā)現極低濃度的Zeb和丁酸鈉對LOVO細胞的生長有促進作用:50 μmol/L的Zeb和2 mmol/L的丁酸鈉作用于LOVO細胞48 h后對細胞的抑制率為分別-3.6%和-4.5%。產生這種結果的原因還有待于進一步的研究。

抑癌基因的沉默是多種機制參與的結果，Zeb和丁酸鈉分別通過不同的機制使沉默的抑癌基因重新表達，二者的聯用產生了更加有效的抑癌效果，這一點在我們的研究中得到證實。更有意義的是，Zeb和丁酸鈉都是選擇性很強的抗腫瘤藥物，對正常細胞的細胞毒作用小，這在臨床用藥上具有很大的優(yōu)勢。

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