張艷麗，姚樹坤，劉俊寶

1.中日友好醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100029;2.北京朝陽區(qū)三環(huán)腫瘤醫(yī)院

十二指腸胃反流(duodenogastric reflux，DGR)是十二指腸內(nèi)容物反流至胃內(nèi)所引起的一種生理或病理現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)反流至胃內(nèi)的膽汁、胰液和腸液等十二指腸內(nèi)容物可直接造成胃黏膜損傷，嚴(yán)重者造成膽汁反流性胃炎甚至誘發(fā)細(xì)胞癌變［1-2］。然而其作用機制目前尚不清楚，而且DGR相關(guān)疾病的臨床療效并不理想。我們成功引流SD大鼠十二指腸混合液(包括膽汁+胰液+十二指腸液)，通過灌胃建立DGR損傷胃黏膜的動物模型，觀察胃黏膜細(xì)胞凋亡及相關(guān)細(xì)胞因子的表達規(guī)律，為闡明DRG的胃黏膜損傷機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年SD大鼠26只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半。其中10只進行手術(shù)后制備并收集十二指腸混合液(包括膽汁+胰液+十二指腸液);其余16只隨機分為兩組:DGR模型組(8只)和對照組(8只)。所有大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物等級Ⅱ級，合格證編號DK0407-0049。

1.2 方法

1.2.1 十二指腸內(nèi)容物的制備和收集:SD大鼠術(shù)前禁食24 h不禁水，2%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉，局部碘伏消毒，取劍突下及腹中線作約3 cm的切口切腹，翻起肝臟后，找到胃幽門與十二指腸交界處，在十二指腸距幽門約1 cm處剪口，插入聚乙烯管引流胃液，結(jié)扎十二指腸上端，固定及縫合。在十二指腸遠(yuǎn)端10 cm處的腸壁上剪口，此處插入兩根聚乙烯管，一根引流膽汁+胰液+十二指腸液，另一根定時定量(2 mL/4 h)注入葡萄糖-鹽水及純牛奶，以維持大鼠生命活動。導(dǎo)管均結(jié)扎固定。肝腸復(fù)位，關(guān)腹前腹腔內(nèi)注入溫生理鹽水1 mL，逐層縫合腹膜、肌層和皮膚，收集導(dǎo)管固定在動物背部。將收集到的膽汁+胰液+十二指腸液保存于小塑料管，置于-20℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2.2 DGR動物模型的建立:將收集的膽汁+胰液+十二指腸液給SD大鼠灌胃制備DGR模型，自灌胃前一天起每天18:00供給大鼠標(biāo)準(zhǔn)鼠料15 g/只，正常飲水。每天8:30、11:30、14:30和17:30按照0.3 mL/100 g體質(zhì)量給大鼠灌胃，共14 d。對照組大鼠給予同等量生理鹽水灌胃。

1.3 主要試劑 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，一抗TNF-α(toumor necrosis factor)、ET-1(endothelin-1)和 NOS-2(nitric oxide synthase 2)，SP試劑盒及DAB顯色劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司(santa cruze公司產(chǎn)品)。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)本的處理:DGR模型組和對照組均灌胃14 d，第15天斷頭方法處死大鼠。剖腹取胃，自胃幽門向上剪開胃，肉眼觀察大體病理改變，遂將胃分割為胃底、胃體和胃幽門三部分，每部分標(biāo)本置于甲醛內(nèi)固定，石蠟包埋，作厚5 μm連續(xù)切片分別用于:HE染色光學(xué)顯微鏡觀察、細(xì)胞凋亡檢測和免疫組織化學(xué)研究。

1.4.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡:大鼠胃黏膜組織切片常規(guī)脫蠟至水。用蛋白酶K室溫孵育15～30 min后，加TUNEL反應(yīng)混合溶液標(biāo)記，在濕盒中孵育60 min。信號轉(zhuǎn)化和分析，擦干樣品周圍的水分，加入50 μL轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，加入50～100 μL DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次。封片后在光鏡下分析結(jié)果。結(jié)果判定:所有標(biāo)本均在Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)內(nèi)在相同的放大倍數(shù)下觀察，每張切片觀察500個以上胃黏膜上皮細(xì)胞，計算每100個上皮細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。細(xì)胞核內(nèi)有棕色或棕褐色顆粒彌漫分布者為陽性反應(yīng)［3］。

1.4.3 免疫組化法觀察TNF-α、ET-1和NOS-2的表達:主要步驟如下:石蠟切片脫蠟至水;3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;抗原修復(fù)時滴加10%正常山羊血清封閉，滴加一抗(1∶100稀釋)，4℃冰箱過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗IgG，37℃孵育30 min;滴加辣根酶HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液三抗，37℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min;DAB顯色;復(fù)染;酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判定:參照 El-Assal［4］及 Ohmori等［5］描述的方法計算 TNF-α、ET-1和NOS-2表達指數(shù)(expression index，EI)，即陽性目標(biāo)平均光密度×陽性目標(biāo)面密度×100%，其中陽性目標(biāo)平均光密度為抗原表達的強度，在監(jiān)視器上越亮，染色越深;陽性目標(biāo)面密度表示陽性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場面積，值越大陽性目標(biāo)占的比例越大。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 12.0分析軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用用χ2檢驗。分析時檢測正態(tài)性和方差齊性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下形態(tài)觀察 DGR模型大鼠胃黏膜可見胃小凹增生、間質(zhì)水腫、少量淋巴細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，以及輕中度黏膜萎縮及杯狀細(xì)胞化生。而對照組胃黏膜組織未見明顯異常。

2.2 大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡情況 生理鹽水對照組大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞主要位于胃底腺頸部表面，呈單個散在分布。DGR模型組大鼠胃黏膜凋亡細(xì)胞在黏膜全層均可見，主要位于胃底腺頸部，分布密集，形成凋亡細(xì)胞帶。凋亡細(xì)胞呈棕褐色，體積小，形態(tài)呈濃縮或碎點狀，不規(guī)則，大小不一致，周圍無炎癥反應(yīng)。非凋亡細(xì)胞被蘇木素復(fù)染成藍色，核較大，形態(tài)大小較為一致(見圖1)。DGR模型組凋亡指數(shù)(AI)也顯著高于對照組(P＜0.05，見表1)。

圖1 胃黏膜細(xì)胞凋亡(TUNEL 400×)A:DGR模型組;B:對照組Fig 1 Apoptosis cell in DGR model group and control group(TUNEL 400×)

2.3 大鼠胃黏膜細(xì)胞TNF-α、ET-1和NOS-2的表達

2.3.1 TNF-α表達:DGR模型組TNF-α主要表達于胃腺體部及底部細(xì)胞漿，呈黃色或棕黃色，對照組主要表達于胃腺底部。DGR模型組的表達指數(shù)(EI)顯著高于對照組(P＜0.05，見表1)。

2.3.2 ET-1表達:ET-1在胃黏膜全層均可見表達，主要表達于胃腺體部及底部細(xì)胞漿，呈黃色或棕黃色。DGR模型組EI明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)。

2.3.3 NOS-2表達:NOS-2主要表達于胃腺頸部及底部的細(xì)胞漿，呈黃色或棕黃色。DGR模型組的EI明顯高于對照組(P＜0.05，見表1)。

表1 各組大鼠細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子表達的比較±s)Tab 1 The comparison of cell apoptosis and the expression of cytokines in rats(±s)

表1 各組大鼠細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子表達的比較±s)Tab 1 The comparison of cell apoptosis and the expression of cytokines in rats(±s)

組別 例數(shù) 凋亡指數(shù) TNF-α表達指數(shù) ET-1表達指數(shù) NOS-2表達指數(shù)DGR模型組810.51±4.05 1.95±1.01 2.51±0.49 3.67±0.11對照組83.45±2.21 0.75±0.39 1.83±0.61 1.67±0.68 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

以往的實驗研究中DGR動物模型多采用胃空腸吻合術(shù)使十二指腸液反流入胃內(nèi)［6］。而本研究成功地將細(xì)聚乙烯管插入十二指腸引流出膽汁+胰液+十二指腸液的混合物，再進行灌胃制成原發(fā)性DGR模型，病理顯示胃黏膜炎性改變，主要限于黏膜淺層，炎細(xì)胞浸潤主要淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，也可見少量嗜酸性粒細(xì)胞。此外可見固有膜平滑肌纖維和胃小凹增生。以上均提示造模成功，該方法的優(yōu)點是保證了胃十二指腸解剖結(jié)構(gòu)的完整性，能夠很好地模擬人類原發(fā)性十二指腸胃反流的過程，有一定的臨床實用價值。

十二指腸胃反流物對胃黏膜的慢性損傷最終可誘發(fā)細(xì)胞癌變，國外學(xué)者Seven等［6］曾建立單純胃空腸吻合模型，觀察50周發(fā)現(xiàn)大鼠43%發(fā)生腺癌，14%為異型性增生，43%為腸化生，但其確切機制尚無定論。近年來研究發(fā)現(xiàn)凋亡可能參與胃黏膜的損傷過程。因此，有必要通過DGR動物模型，探討在十二指腸胃反流損傷胃黏膜過程中細(xì)胞凋亡的作用，進一步明確可能的發(fā)病機制。

TUNEL法通過從細(xì)胞水平檢測凋亡時產(chǎn)生的特異性核小體片段所伴有的大量3'-OH來檢測凋亡細(xì)胞，是目前原位檢測凋亡細(xì)胞中靈敏度、特異度均較高的方法［3］。我們利用TUNEL法檢測DGR模型的胃黏膜細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組的細(xì)胞凋亡主要在黏膜表層散在分布，而DGR模型組呈連續(xù)分布或成堆出現(xiàn)，凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05)。細(xì)胞凋亡的增加可導(dǎo)致胃黏膜的萎縮，可能是萎縮性胃炎發(fā)生的原因之一。另外，胃黏膜上皮細(xì)胞大量凋亡時，可能會有代償性增殖加快，如果致凋亡因素長期慢性作用，細(xì)胞增殖過度而出現(xiàn)異常增殖甚至細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程，那么細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)紊亂可能是十二指腸胃反流造成胃黏膜損傷乃至細(xì)胞癌變的發(fā)病機制之一。很多研究顯示多種細(xì)胞因子對細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。本研究中利用免疫組化方法檢測了胃黏膜組織中的TNF-α、ET-1和NOS-2的表達，發(fā)現(xiàn)DGR模型組三種細(xì)胞因子的表達均顯著高于生理鹽水對照組。

TNF-α是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞受外界因素刺激后釋放的一種細(xì)胞因子［7］。其對細(xì)胞的誘導(dǎo)作用已得到公認(rèn)，目前認(rèn)為TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過與靶細(xì)胞膜上特異性受體(TNFR)結(jié)合后，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列信號通路，從而影響細(xì)胞增殖和凋亡［8］。本研究中，DGR模型組的TNF-α表達指數(shù)顯著高于對照組，進一步說明十二指腸胃反流物刺激胃黏膜，通過分泌TNF-α誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡而造成胃黏膜損傷。

ET-1是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的生物活性肽，是一種對胃黏膜損傷作用很強的內(nèi)源性遞質(zhì)。多種原因誘發(fā)的急性胃黏膜損傷能使血漿ET水平明顯升高。Slomiany等［9］的研究發(fā)現(xiàn)吲哚美辛致大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡增加，ET-1的含量也升高3.1倍。本研究中，DGR模型組胃黏膜細(xì)胞的ET-1表達指數(shù)明顯高于對照組，進一步證明ET-1可能參與胃黏膜細(xì)胞凋亡過程。也有研究顯示ET-1可能通過促進TNF、IL-2、IL-6的產(chǎn)生并干擾細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道和磷脂酶的活性而發(fā)揮作用。NO是一種極不穩(wěn)定的小分子，故多通過測定NOS來反映NO水平。NOS又分為不同的亞型，而研究發(fā)現(xiàn)NOS-1抑制凋亡、NOS-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。我們的研究發(fā)現(xiàn):DGR模型組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡增加的同時，胃黏膜局部的NOS-2表達明顯高于對照組。推測DGR損傷胃黏膜，局部微循環(huán)改變，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，包括NOS-2大量釋放，后者誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。這和Bonde等［11］的結(jié)論一致。

綜上所述，我們的研究顯示發(fā)生十二指腸胃反流時，胰液+膽汁+十二指腸液的混合物損傷胃黏膜過程中，胃黏膜的TNF-α、ET-1和NOS-2表達明顯升高，大量細(xì)胞因子的釋放可能誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)了胃黏膜的細(xì)胞凋亡過程。然而多種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的互相作用和制約、細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)紊亂是非常復(fù)雜的過程，所以十二指腸胃反流造成胃黏膜損傷乃至細(xì)胞癌變的確切機制仍需要進一步的深入研究。

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