周立遠(yuǎn) 吳天清 張旭東 王家珍

（川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院 三臺(tái)縣人民醫(yī)院，四川 三臺(tái) 621100）

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）在Ca+信號(hào)通路中扮演一個(gè)重要的多功能調(diào)節(jié)因子[1]?？烧{(diào)節(jié)神經(jīng)介質(zhì)釋放神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)發(fā)育，與學(xué)習(xí)記憶和老年癡呆有關(guān)；在T細(xì)活化中起調(diào)節(jié)樞紐作用；在細(xì)胞凋亡中起中心環(huán)節(jié)作用，尤其是新近研究表明CaN-T細(xì)胞活化核因子（NF-AT3）途徑廣泛存在于心肌、血管平滑肌細(xì)胞等，CaN可參與維持心血管結(jié)構(gòu)和功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、心肌細(xì)胞肥大，在心血管生理及病理生理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[2]。

CaN具有促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)及產(chǎn)生生理病理變化的作用，但CaN的作用效果跟年齡關(guān)系的研究較少。我們對(duì)不同年齡大鼠心臟和主動(dòng)脈平滑肌組織的CaN活性測(cè)定，進(jìn)一步證實(shí)它們?cè)谛难苤械慕M織分布差異性，觀察它們?cè)跈C(jī)體衰老過(guò)程中隨年齡變化的趨勢(shì)，提供關(guān)于心血管老化的一些研究根據(jù)，并查找相關(guān)原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器：超低溫冰箱（USA）；高速離心機(jī)；UV-1100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；SN-695B型γ放射免疫計(jì)數(shù)儀；6531型電動(dòng)攪拌機(jī)（勻漿機(jī)）；DHG-9070型恒溫干燥箱。

1.1.2 主要試劑及配制：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。該試劑盒有十一種試劑，其中定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。其他用品都是國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選購(gòu)溫州研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的Wistar大鼠，隨機(jī)選擇1月年齡的大鼠12只、6月年齡的大鼠12只及24月年齡的大鼠12只，雌雄個(gè)體不再隨機(jī)分配，1月年齡的大鼠體質(zhì)量約為103.7g，6月年齡的大鼠體質(zhì)量約為230.1g，24月年齡的大鼠體質(zhì)量約為331.2g。把所購(gòu)大鼠按年齡分為三組，即分為1月年齡組、6月年齡組和24月年齡組，并在各組內(nèi)分別隨機(jī)選擇12例健康大鼠，可命名為幼年組、青年組、老年組。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 在大鼠腹部注入50mg/kg的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，立即剖開(kāi)胸部，在右心室內(nèi)取出2mL血液，并將其放入抗凝試管內(nèi)，與由0.3M EDTA二鈉30μL、0.34M 8-羥基喹啉30μL及0.32M二硫基丙醇15μL組成的抑肽酶混合均勻，并在冰水中進(jìn)行冷卻到4℃，1000r/min離心5min，最后把分離出來(lái)的血漿放入冰箱內(nèi)冷藏。

1.2.2 取出心臟血液后，應(yīng)立即用生理鹽水把主動(dòng)脈和心臟洗凈并放入液氮，然后取出剪碎，一半加入4倍體積的組織勻漿液（MOPS 0.1mol/L、pH 7.0、EDTA 2mmol/L、PMSF 75mg/L、trypsin in-hibitor 10mg/L、TPCK 10mg/L、leupeptin 1mg/L），在Polytron勻漿器上勻漿然后低溫離心機(jī)中（4℃）以14000r/min離心30min，上清即為組織提取液。少量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織提取液中蛋白含量，其余作酶活性測(cè)定。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 蛋白含量測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定心臟和主動(dòng)脈平滑肌中CaN蛋白含量。

1.3.2 取組織勻漿上清液用生理鹽水按比例稀釋成2%組織勻漿液。

1.3.3 按表1操作。

表1 操作步驟

混勻，靜置10min，于595nm處，1cm光徑，UV-1100型分光光度計(jì)測(cè)定OD值。

1.3.4 蛋白含量計(jì)算：蛋白含量（g/L）=測(cè)定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（g/L）。

1.4 CaN活性測(cè)定

試劑共11種，檢測(cè)時(shí)現(xiàn)配備1mmol/L標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液和定磷劑然后按照說(shuō)明操作。

CaN活性計(jì)算：規(guī)定每小時(shí)每毫克蛋白的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶分解底物PNPP產(chǎn)生1μmol/L無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)CaN活性單位。

公式：組織中CaN活力（nmol Pi/mg protein/hour）=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管磷含量×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)×3÷取樣量中蛋白毫克數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用（±s）來(lái)表示。各組之間的差異運(yùn)用單因素方差分析SNK法和t檢驗(yàn)法來(lái)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

不同月齡大鼠心肌及主動(dòng)脈組織CaN的活性減檢測(cè)顯示：大鼠心肌與主動(dòng)脈組織CaN活性隨月齡增大而降低，三組間相比差異有顯著性（P＜0.05），不同月齡大鼠心肌組織CaN活性比同月齡主動(dòng)脈CaN活性高（P＜0.05）。不同月齡大鼠心血管組織中CaN活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同月齡大鼠心血管組織中CaN活性測(cè)定結(jié)果[(±s)，(nmol Pi/mg protein/hour)]

表2 不同月齡大鼠心血管組織中CaN活性測(cè)定結(jié)果[(±s)，(nmol Pi/mg protein/hour)]

注：大鼠心肌CAN活性與1月齡組比較，◎P＜0.05；與6月齡比較，☆P＜0.05；主動(dòng)脈CAN活性與1月齡組比較，○P＜0.05；與6月齡比較，◆P＜0.05；1月齡組間主動(dòng)脈CAN活性與心肌CAN活性比較（★P＜0.05）；6月齡組間主動(dòng)脈CAN活性與心肌CAN活性比較（▲P＜0.05）；24月齡組間主動(dòng)脈CAN活性與心肌CAN活性比較（●P＜0.05）

1月齡組(n =12) 6月齡組(n =12) 24月齡組(n =12)心臟CaN活性 2.84±0.61 2.26±0.45◎ 1.58±0.38◎☆主動(dòng)脈CaN活性 2.10±0.58★ 1.56±0.35○▲ 1.06±0.43●○◆

3 討 論

迄今為止，CaN為僅有的一類(lèi)通過(guò)Ca2+/鈣調(diào)素（Calmodulin）在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)酶類(lèi)，這種酶是絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶在教科書(shū)中又被稱為蛋白磷酸酶2B，PP2B。CaN具有去磷酸化的效果，其重要的生理作用為通過(guò)多條信號(hào)傳導(dǎo)或利用去磷酸化的作用來(lái)調(diào)節(jié)其他信號(hào)傳導(dǎo)方式，從而起到調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)和其他第二信使聯(lián)合作用的效果，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能[3]。

心肌肥大可能為內(nèi)皮素、生長(zhǎng)因子、血管緊張素Ⅱ等因素引起的肌肉肥大或心肌細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)而變肥厚，也可能為先天性心臟缺陷所導(dǎo)致，其作用的共同特征都是引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高或?qū)a2+的敏感性增強(qiáng)是心肌肥大發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，而肥大基因的過(guò)度表達(dá)是各種病理刺激心肌肥大的共同分子機(jī)制。CaN作為唯一的Ca2+/CaM依賴的蛋白磷酸酶，其活性變化勢(shì)必受到血管平滑肌細(xì)胞Ca2+濃度的影響，從而激活終止或肥大信號(hào)過(guò)度表達(dá)[4]。很多研究觀察應(yīng)用CsA處理后，心肌組織及血漿ANP含量分別下降了16%和14%。結(jié)果提示，CaN在壓力超荷性心肌肥大的信號(hào)傳遞中也可能起到重要作用[5]。

對(duì)不同年齡的大鼠腦中CaN含量與活力研究結(jié)果反映，CaN在大鼠腦發(fā)育時(shí)期含量與活力均呈有規(guī)律地變化，特別是在大鼠出生后2周左右，CaN含量與活力都顯著地升高。胎兒腦組織出生前4周內(nèi)增長(zhǎng)較快；特別是出生后1周左右，CaN比活力達(dá)高峰，以后呈緩慢下降趨勢(shì)；至成人后則基本穩(wěn)定不再有較大的波動(dòng)。正常雌性大鼠在性成熟前，生長(zhǎng)發(fā)育速度很快，子宮平滑肌組織CaN的活性隨年齡增長(zhǎng)逐漸增加，到性成熟后（16周后）穩(wěn)定在較高水平。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠的心肌和主動(dòng)脈平滑肌組織中，心肌里的CaN的活性明顯比主動(dòng)脈平滑肌組織高，這些可能與不同組織功能及發(fā)育早晚有關(guān)。心肌與血管平滑肌中CaN的活性隨著年齡的增長(zhǎng)而增高，分析原因可能為心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子起著尤其重要的傳導(dǎo)作用，起著參與心肌做功及細(xì)胞能量代謝的生理功能，若能量代謝發(fā)生故障，便會(huì)因細(xì)胞內(nèi)清除鈣離子能力降低而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超負(fù)荷。鈣離子的超負(fù)荷會(huì)使線粒體受損，從而導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)的障礙，引起能量減少，便會(huì)導(dǎo)致惡性循環(huán)的發(fā)生。因此本次調(diào)查結(jié)果為：鈣離子超負(fù)荷是引起缺氧后導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆性損傷及細(xì)胞凋亡的重要原因[6]。Ca2+超負(fù)荷的程度越高，則心肌細(xì)胞功能的影響也就越大[7]。CaN在出生后在其含量維持在一定的水平上，對(duì)心血管組織發(fā)育，功能維持發(fā)揮重要作用，但同時(shí)隨著年齡的增長(zhǎng)，心血管系統(tǒng)中受體的下調(diào)以及其他相關(guān)酶系統(tǒng)活性的降低，CaN的活性也是降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出在心肌與主動(dòng)脈該CaN隨著年齡的增加其活性是逐漸下降的。CaN活性年齡增加而降低。它們的組織分布差異性與年齡的變化特點(diǎn)，為心血管老化研究提供新的思路。

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