李伶俐， 向紅瓊， 李興紅， 嚴(yán) 紅， 楊臘英， 燕繼曄

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)與環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，儋州 571737）

由甘藍(lán)枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans）引起的甘藍(lán)枯萎病是一種典型的土傳病害［1]，受害甘藍(lán)在苗期即可發(fā)病，最初表現(xiàn)為葉脈變黃，隨著病情的發(fā)展，整葉或全株變黃，進(jìn)而植株變小而萎蔫，最后枯死，剖開植株的短縮莖可見維管束明顯變褐。該病在大葉芥上的癥狀與甘藍(lán)相似，也表現(xiàn)為萎蔫、黃化及枯死［2]。1895年，Smith在美國首次發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)枯萎病，該病害在美國東北部蔓延，隨后在加拿大、日本等國家也相繼報(bào)道［3－6]，近年來，這種病害在我國北京、河北等地發(fā)生并蔓延迅速［7]。生產(chǎn)上除抗病品種選育外，至今沒有其他的有效防治措施。

解析病原真菌的致病機(jī)理可以通過特定性狀突變體篩選和鑒定特定性狀基因功能來實(shí)現(xiàn)。通過突變體分離致病相關(guān)基因時(shí)，如何評價(jià)轉(zhuǎn)化子的致病力是最關(guān)鍵的因素?？焖佟⒖煽?、重復(fù)性強(qiáng)、高通量是評價(jià)轉(zhuǎn)化子致病力測定的幾個(gè)重要指標(biāo)。國內(nèi)外對甘藍(lán)枯萎病菌致病機(jī)理的研究還比較匱乏，而建立一種快速評價(jià)甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力的方法將有助于致病力變異突變體的篩選，為后期克隆控制甘藍(lán)枯萎病菌致病力的功能基因、鑒定基因功能、解析甘藍(lán)枯萎病菌致病機(jī)理提供幫助，也為甘藍(lán)枯萎病的防治提供理論支持。本研究在綜合考慮影響篩選致病力變異突變體的基礎(chǔ)上經(jīng)過探索和優(yōu)化，最終建立了一個(gè)能夠較好評價(jià)甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力細(xì)微差異的體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

甘 藍(lán) 枯 萎 病 菌 （Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans）野生型菌株JZB310079，分離自北京市延慶縣甘藍(lán)產(chǎn)區(qū)，保存在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)與環(huán)境保護(hù)研究所植物病害綜合防治研究室。

甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子共10個(gè)，是通過PEG介導(dǎo)將GFP基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)枯萎病菌JZB310079的原生質(zhì)體后獲得的隨機(jī)轉(zhuǎn)化子（結(jié)果未報(bào)道），編號為PDM01～PDM10，均以濾紙片保存于－20℃冰箱。

育苗基質(zhì)（蛭石與土混合），購自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心。

1.1.2 甘藍(lán)品種

‘中甘21’和‘中甘15’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 甘藍(lán)苗種植

將大約5g甘藍(lán)種子放入100mL燒杯，加入約70mL 60～65℃的熱水，用玻璃棒不停地?cái)嚢瑁了疁亟抵?7℃以下時(shí)停止攪拌，繼續(xù)浸泡種子15min，將其均勻地撒在用水浸濕的濾紙上，放入28℃培養(yǎng)箱，過夜萌發(fā)。將育苗基質(zhì)倒入干凈苗盤中，用滅菌牙簽將萌發(fā)出芽的種子播種到育苗盤，輕輕鋪上一層基質(zhì)后澆少量的水，放入溫室培養(yǎng)（25～28℃），每隔24h澆水1次，直至幼苗生長到合適葉齡。

1.2.2 接種體制備

用無菌棉棒將PDA培養(yǎng)基（9cm）上培養(yǎng)3～5d的甘藍(lán)枯萎病菌野生型及轉(zhuǎn)化子的菌絲輕輕刮下，用2～3mL無菌水反復(fù)沖洗并打斷菌絲，吸取菌絲裝至150mL液體CM培養(yǎng)基的搖瓶中搖培36h（120r／min，28℃），用無菌紗布濾去菌絲，濾液離心（4 000r／min，10min）后，用無菌水將沉淀的孢子稀釋到合適濃度備用。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂粉1.6%。

液體CM培養(yǎng)基：0.6%酵母提取物，0.3%酶水解干酪素，0.3%酸水解干酪素，1%蔗糖。

1.2.3 接種方法

蘸根法：苗盤中生長到合適苗齡的幼苗放入接種體中浸泡15～20min，植入育苗杯，溫室培養(yǎng)（25～28℃），接種14d后進(jìn)行病情觀察。

灌根法：稀釋到一定濃度的接種體直接澆灌幼苗的根系部，植入育苗杯中，溫室培養(yǎng)（25～28℃），接種14d后進(jìn)行病情觀察。

傷根法：用無菌刀片切下幼苗根部約2～5mm的根系部分，稀釋好的接種體浸泡幼苗受傷的根系15min后，植入育苗杯，接種14d后進(jìn)行病情觀察。

以上3種接種方法都以同樣條件用清水浸泡處理幼苗作為對照，接種14d后進(jìn)行病情觀察，并且在接種后24h內(nèi)禁止?jié)菜?，此后每?4h澆水1次。

1.2.4 幼苗接種的時(shí)期

分別采用苗齡為三葉期和五葉期的甘藍(lán)幼苗進(jìn)行接種，三葉期指第1、2片葉完全展開，第3片葉抽出并剛展開的時(shí)期。五葉期指第1～4片葉完全展開，第5片葉抽出并剛展開的時(shí)期。

1.2.5 病情指數(shù)

對生長到合適葉齡的甘藍(lán)植株接種14d后進(jìn)行觀察。每個(gè)植株按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級：0級，無?。?級，僅子葉變黃，真葉無癥狀；2級，子葉枯死，下部真葉變黃；3級，有1、2片真葉枯死，但心葉無癥狀；4級，整株枯死［8]。病情指數(shù)（DI）計(jì)算公式如下：

甘藍(lán)品種按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗、感病分類：0＜DI≤10，高抗（HR）；10＜DI≤30，抗?。≧）；30＜DI≤50，中抗（MR）；50＜DI≤70，感病（S）；70＜DI，高感（HS）。

1.2.6 甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力差異評價(jià)

根據(jù)優(yōu)化的最佳方法（合適菌齡、合適苗齡、接種濃度、接種方法等）評價(jià)10株甘藍(lán)枯萎病菌隨機(jī)轉(zhuǎn)化子和甘藍(lán)枯萎病野生型菌株的致病力差異，轉(zhuǎn)化子菌株和野生型菌株做一組對照，每個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株接種5株幼苗，野生型菌株接種10株幼苗，同樣條件下，用清水接種5株幼苗作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種濃度對甘藍(lán)枯萎病發(fā)病的影響

采用蘸根法分別用孢子濃度為1×106個(gè)／mL和1×104個(gè)／mL的接種體接種三葉期幼苗后，前者的感病數(shù)量要多于后者（見圖1），因此在進(jìn)行甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子致病力評價(jià)時(shí)采用孢子濃度為1×106個(gè)／mL的接種體。

圖1 不同接種濃度對發(fā)病的影響

2.2 不同接種方法對甘藍(lán)枯萎病發(fā)病的影響

用蘸根法和傷根法接種，植株感病數(shù)量相當(dāng)（圖2），發(fā)病率均為90%，而灌根法接種后的感病效果明顯沒有蘸根法和傷根法的效果好，發(fā)病率為67%。這可能是因?yàn)檎焊ê蛡ń臃N體的孢子直接與植株根系接觸，孢子直接侵染接種植株，導(dǎo)致植株感病快。從操作來看，蘸根法更容易操作，故以后的致病力評價(jià)試驗(yàn)優(yōu)先選擇蘸根法。

圖2 不同接種方法對發(fā)病的影響

2.3 不同時(shí)期接種對甘藍(lán)枯萎病發(fā)病的影響

蘸根法接種三葉期植株后的感病數(shù)量要多于用五葉期植株接種（見圖3）。作者推測可能是因?yàn)槿~期的植株較幼嫩，抗病能力不強(qiáng)，容易感病。同時(shí)，培養(yǎng)甘藍(lán)生長至三葉期時(shí)間較短，故在進(jìn)行轉(zhuǎn)化子致病力評價(jià)時(shí)采用三葉期的甘藍(lán)幼苗。

圖3 不同時(shí)期接種對發(fā)病的影響

2.4 轉(zhuǎn)化子致病力的差異分析

甘藍(lán)枯萎病菌10個(gè)轉(zhuǎn)化子和野生型菌株接種甘藍(lán)（品種為‘中甘21’）幼苗后（感病植株見圖4），可以觀察到接種的甘藍(lán)幼苗表現(xiàn)不同的發(fā)病程度，見表1。

表1 甘藍(lán)接種不同轉(zhuǎn)化子后的病情指數(shù)1）

試驗(yàn)結(jié)果表明，用蘸根法接種可以比較合理地評價(jià)甘藍(lán)枯萎病菌轉(zhuǎn)化子的致病力差異，用此方法可以篩選到致病力衰弱或者增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子。

2.5 甘藍(lán)品種的抗性

野生型菌株接種三葉期的‘中甘21’，14d后的病情指數(shù)為65（表1），按照前述方法中的甘藍(lán)品種抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，‘中甘21’對野生型菌株JZB310079而言屬于感?。⊿）品種。

野生型菌株接種三葉期‘中甘15’，14d后的病情指數(shù)DI為47.5，按照前述方法中的甘藍(lán)品種抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，‘中甘15’對野生型菌株JZB310079而言屬于中抗（MR）品種。

圖4 轉(zhuǎn)化子和野生型菌株接種結(jié)果的比較

因此，適合甘藍(lán)枯萎病菌JZB310079菌株轉(zhuǎn)化子致病力評價(jià)的品種為‘中甘21’。

3 結(jié)論與討論

本研究主要從接種方法、不同苗齡、接種體濃度3方面進(jìn)行探索，研究結(jié)果表明，使用蘸根法或傷根法，接種苗齡為三葉期，接種體孢子濃度為1×106個(gè)／mL時(shí)，甘藍(lán)幼苗的感病數(shù)量較多，與甘藍(lán)黑腐病抗性材料篩選［9]的結(jié)果相似。蘸根法或傷根法比灌根法接種幼苗感病數(shù)量更多，可能是由于蘸根法和傷根法中的孢子直接接觸幼苗根部，使其較易發(fā)病；三葉期接種比五葉期接種發(fā)病數(shù)量更多，可能是三葉期植株較幼嫩，抗病性較弱；孢子濃度為1×106個(gè)／mL蘸根后的發(fā)病率要高于濃度為1×104個(gè)／mL接種的發(fā)病率，可能是接種體的濃度越高植株越易發(fā)病。

試驗(yàn)過程中應(yīng)注意以下問題：種子浸泡在熱水中時(shí)要不停地?cái)嚢璺N子，以免種子被燙死；把幼苗由苗盤轉(zhuǎn)到育苗杯中時(shí)要輕輕拔起，以免幼苗根部被拔斷；接種過程中在做對照時(shí)要避免育苗基質(zhì)被雜菌污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明：在相同條件下，用野生型菌株和轉(zhuǎn)化子分別接種甘藍(lán)幼苗，雖然接種后甘藍(lán)幼苗都表現(xiàn)出不同程度的發(fā)病癥狀，但是用轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液接種植株后發(fā)病率要低于用野生型菌株接種的發(fā)病率，有可能是因?yàn)樗褂玫木G色熒光蛋白載體是隨機(jī)插入甘藍(lán)枯萎病菌的染色體，不排除這個(gè)載體剛好插入到致病相關(guān)基因，也不排除在PEG介導(dǎo)的同源重組過程中染色體發(fā)生了缺失、顛換等現(xiàn)象，導(dǎo)致了控制甘藍(lán)枯萎病菌致病力的基因發(fā)生突變，表現(xiàn)出菌株致病力下降。但轉(zhuǎn)化子接種甘藍(lán)幼苗后植株表現(xiàn)出致病力差異，可以初步表明該接種方法可以用來篩選轉(zhuǎn)化子的致病力變化突變體，該方法為下一步尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化子增強(qiáng)或衰弱突變體的篩選提供了基礎(chǔ)，也為鑒定克隆甘藍(lán)枯萎病菌致病力相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

［1]耿麗華，遲勝起，康俊根，等.北京延慶縣甘藍(lán)枯萎病病原菌的分離及其生物學(xué)特性的研究［J].中國蔬菜，2009（2）：34－37.

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